Методы определения санитарно-показательных микроорганизмов воды, воздуха и почвы

Санитарно-бактериологическое исследование воды. Отбор проб воды. Точность результатов исследования воды зависит от способов отбора, хранения и перевозки проб воды в лабораторию для исследования, а также качества питательных сред, используемых при исследовании. Отбор проб воды производится специально подготовленным лицом (выемщиком проб, лаборантом или помощником санитарного врача) в присутствии представителя организации или учреждения, в ведении которого находится исследуемый водоисточник или водопроводное сооружение.

О выемке составляется акт, в котором указывают местонахождение и наименование сооружения, точки забора и дают краткую характеристику источника или сооружения. Указывают, по чьему заданию производится исследование, цель последнего, время забора (дата и час), должность и фамилия выемщика проб. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Для этой цели используют емкости объемом 500 мл. Горлышко этой посуды должно быть заткнуто силиконовой, резиновой пробкой, обернуто бумажным колпачком и обвязано суровой ниткой. К колпачку привязывают стерильную корковую пробку, завернутую в бумагу. Сосуд, в который предстоит собрать пробу хлорированной воды, должен содержать 2 мл 1,5% стерильного водного раствора гипосульфита (дехлоратора).

На сосуд наклеивают этикетку с указанием номера пробы или же надписывают номер карандашом по стеклу. Для перевозки в лабораторию посуду с пробами устанавливают в ящики типа контейнера, где температура должна поддерживаться в пределах 1-5°. Во время перевозки пробы следует предохранять от резких толчков, опрокидывания и замачивания пробок. В лабораторию они должны быть доставлены через такой промежуток времени, который позволил бы посеять воду не позднее чем через 2 часа с момента ее отбора,

Определение микробного числа. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов – в объемах 1; 0,1 и 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10-12 мл расплавленного и остуженного до 45-50ºС питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37ºС в течение 1-2 суток. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37ºС в течение 1 сут, а другую – 2 сут при 20ºС. Затем подчситывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды - количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Показателями фекального загрязнения воды являются все разновидности кишечной палочки, обладающие следующими свойствами: грамотрицательная, неспороносная, короткая палочка, дающая на среде Эндо рост темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых с темным центром или же бесцветных прозрачных колоний и сбраживающая глюкозу при 43 - 45° в течение 24 часов с образованием кислоты и газа.

БГКП выявляют: 1) методом титрования (бродильный метод); 2) методом мембранных фильтров с целью определения коли-индекса и коли-титра воды.

• Коли-титр воды - это ее наименьшее количество, в котором обнаруживается одна бактерия группы кишечных палочек (БГКП).

• Коли-индекс - количество БГКП в 1 л исследуемой воды.

Метод титрования. Производят посев различных объемов воды в глюкозо-пептонную среду Эйкмана (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок), причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-ти кратные количества указанных веществ.

Для исследования водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С. В случае положительного результата определяют помутнение среды, изменение цвета (с желтого на розовый), появление газа в поплавке. Из положительных проб делают посев на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по методу Грама и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter (БГКП) от оксидазоположительных бактерий семейства Enterobactericeae, Pseudomonadaceae. При постановке оксидазного теста оксидазоотрицательные микроорганизмы не изменяют цвет тестовых полосок, а оксидазоположительные меняют цвет тест-полоски на синий. Коли-титр и коли-индекс определяется с помощью статистической таблицы (см. рабочую тетрадь).

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрованием разводят стерильной водой.

Рис. 17. Метод мембранных фильтров

После окончания фильтрации фильтр стерильным пинцетом накладывают нижней стороной на поверхность среды Эндо в чашке Петри, избегая при этом образования пузырьков между средой и фильтром. После суточной инкубации при температуре 37°С подсчитывают количество колоний, выросших на мембранном фильтре типичных для БГКП. Из 2-3 колоний ярко-малинового цвета с характерным металлическим блеском готовят мазки, окрашивают по методу Грама и определяют оксидазную активность. БГКП представлены грамотрицательными одиночными палочками, не обладающими оксидазной активностью. Пересчетом этого числа на количество БГКП в 1 л воды определяют коли-индекс. Коли-титр вычисляют делением 1000 на число, выражающее, коли-индекс (коли-титр=1000/коли-индекс). Например, если коли-индекс равен 10, то коли-титр равен 1000:10=100 мл.

Нормативы питьевой воды (ГОСТ 2874-82) – МИКРОБНОЕ ЧИСЛО НЕ БОЛЕЕ 100 в 1 МЛ, ЧИСЛО БГКП (БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК) В 1 Л ВОДЫ (коли-индекс) НЕ БОЛЕЕ 3 и (коли-титр) НЕ МЕНЕЕ 333 МЛ.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Метод седиментации (метод Коха). Основан на оседании бактериальных частиц под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Для проведения метода Коха две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 минут, после чего посевы инкубируют в термостате при 37ºС. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250-500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колонии более 500 – загрязненным. Для обнаружения определенных видов микроорганизмов могут быть использованы специальные питательные среды: кровяной агар (гемолитические стафилококки и стрептококки), ЖСА (золотистый стафилококк). Однако метод оседания не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха, так как на открытых чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц. Поэтому метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют другие, более совершенные приборы и методы.

Аспирационный метод основан на ударном действии воздушной струи о поверхность питательной среды. Это более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Для исследования воздуха этим методом применяют аспирационный прибор Кротова. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засавывается через узкую щель плекигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чашкой с мясо-пептонным агаром или со специальной средой. Вращение столика с чашкой Петри обеспечивает равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды. К концу заданного времени чашку с посевом воздуха снимают, закрывают ее и помещают в термостат. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле: ОМЧ = А х 1000/V, где А– количество выросших колоний на чашке, V – объем пропущенного через прибор воздуха, л, 1000 – стандартный объем воздуха в литрах. Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 колоний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в минуту. Всего было пропущено 50 л воздуха. ОМЧ=250 х 1000/50=5000 (дм³).

Санитарно-бактериологическое исследование почвы. Отбор проб почвы. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) по принципу почтового конверта и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 10^-3, 10^-4, 10^-5. Из двух последних разведений берут по 0,1 мл и смешивают с 4,0 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45°С питательного агара, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2% питательным агаром. Посевы инкубируют при 37°С, затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют микробное число.

Определение общего числа бактерий. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение в пробирках тщательно перемешивают стерильной пипеткой, после чего из него отбирают 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри под слегка приподнятую крышку.

Из каждого разведения должен быть сделан одновременно посев минимум в 2 чашки. После посева в каждую чашку вливают 15 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45° питательного агара. Расплавленный агар в чашках Петри хорошо перемешивают с имеющейся в них взвесью почвы, осторожно наклоняя чашку во все стороны для равномерного распределения питательной среды по дну чашки Петри, последнюю ставят на горизонтальную поверхность до застывания агара. На крышке чашки отмечают номер пробы и разведение.

После застывания агара, чашки с посевом в перевернутом виде (крышкой вниз) помещают на 48 часов в термостат, настроенный на 28-30°С. Если выращивание производят при более низкой температуре, например 22°С, срок инкубации должен быть увеличен до 72 часов. После инкубации посевов подсчитывают количество выросших колоний. Для подсчета бактерий необходимо брать такие разведения, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. Если на чашках выросло больше 150 колоний и нет других разведений, допускается подсчет колоний на 1/4 чашки с пересчетом на всю ее площадь. Из суммы колоний, выросших на 2 чашках, выводят среднеарифметическое число и затем пересчитывают число колоний на 1 г почвы.

Пример. Посеян 1 мл почвенной суспензии из разведения 1:10000. На всей площади чашки выросло 80 колоний. Это число надо умножить на степень разведения (10000). Получаем, что в 1 г почвы содержится 800 000 бактерий (8х10⁵). Санитарное значение числа сапрофитных бактерий в почве нельзя рассматривать без учета особенностей типа почвы.

Оценку санитарного состояния почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является установление степени фекального загрязнения. Результаты бактериологического исследования почвы выражаются коли-титром, перфрингенс-титром и титром термофильных бактерий почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий почвы. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера (1% пептон, 5% желчь, 0,25% лактоза, генциан виолет для подавления грамположительной флоры) и инкубируют при 43°С в течение 48 часов. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железо-сульфитный агар (среда Вильсона—Блера). Посевы инкубируют при 43°С в течение 24-48 ч, после чего учитывают результаты по свертыванию молока или по образованию черных колоний C. рerfringens в агаровом столбике среды Вильсона-Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму и вычисляют перфрингенс-титр.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60°С, а затем подсчитывают количество выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Таблица 26. Основные микробиологические показатели состояния почвы

Занятие № 2

Поиск по сайту: