Белков методом коагуляции»

Цель работы: Определить изоэлектрический пункт белков методом коагуляции.

Материальное обеспечение: Пробирки, пипетки на 2.5 мл, стаканы, солевой раствор мышечного глобулина 1% р-р, желатины, pH – метр.

Реактивы: 90 % спирт, буферные смеси.

Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.

Ход работы:

Коллоидные растворы белковых амфолитов обладают в изоэлектрическом пункте минимальной стабильностью. Для некоторых белков эта минимальная устойчивость коллоидных растворов сказывается в том, что в изоэлектрическом пункте самопроизвольно коагулируют; другие белки в этом пункте легко коагулируют при добавлении какого - либо осадителя. Это свойство белковых р-ров служит основанием для нижеследующего метода определения изоэлектрического пункта.

1. Определение изоэлектрического пункта желатины.

Готовят 7 пробирок и помещают в каждую 5 мл буферных смесей (нитратно -фосфатных), как указано в следующей таблице:

В каждую пробирку помещают по 2 мл 1% р-ра желатины. В пробирку № 4 добавляют при встряхивании 90% спирт до очень легкого помутнения раствора. Затем в остальные пробирки добавляют такое же количество алкоголя, как в пробирку № 4. После 30-минутного стояния отмечают пробирку с максимальным помутнением и, таким образом, находят pH, отвечающий изоэлектрическому пункту желатины.

2. Определение изоэлектрического пункта мышечного глобулина.

Готовят 8 пробирок и наливают в каждую по 5 мл цитратно – фосфатных буферных смесей следующим образом:

В каждую пробирку добавляют 1 мл молевого р-ра мышечного глобулина. Отмечают пробирку, в которой после встряхивания получается максимальное помутнение; pH буферной смеси в этой пробирке соответствует изоэлектрическому пункту исследуемого протеина.

Оформить отчет в тетради.

Лабораторная работа № 2

«Проведение гидролиза белка. Разделение свободных аминокислот методом распределительной хромотографии»

Цель работы: Провести реакции гидролиза белка, изучить метод обнаружения аминокислот распределительной хромотографией.

Материальное обеспечение: Пробирки, мерный цилиндр на 10 мл, термостат, фильтровальная бумага.

Реактивы: Физиологический раствор, белок куриного яйца, 0.1 % пепсина, 0.2 % р-р соляной кислоты, лакмойд, разбавленный раствор едкого натра, 4-5% р-р казеина, 0.5 % р-р соды, р-р трипсина, изоамиловый спирт, бромовая вода.

Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.

Ход работы:

1. Проведение гидролиза белка.

а) Продукты пептического гидролиза белков:

К 1 мл разбавленного 10 мл 0.1 % р-ра пепсина в 0.2 % соляной кислоте и ставят смесь в термостат при 37 °C на 25-30 минут. После этого к жидкости добавляют несколько капель раствора лакмойда и осторожно разбавленный раствор едкого натра до слабо кислой реакции; при этом выпадает осадок кислотного альбумината, который отфильтровывают. Фильтрат нагревают до кипения, причем выпадает осадок неизмененного белка. Осадок отфильтровывают от еще горячей жидкости и в полученном фильтрате открывают альбумозы и пептоны, как описано ниже.

б) Продукты трипептического гидролиза белков:

20 мл 4-5 % раствора казеина в 0.5 % р-ре соды смешивают с 2-3 мл р-ра трипсина и оставляют в термостате при 37 °C на 30-40 минут. После этого жидкость осторожно подкисляют до слабокислой (на лакмойд) реакции и отфильтровывают выпавший осадок щелочного альбумината. Фильтрат нагревают до кипения, причем выпадает в осадок белок. Жидкость фильтруют еще горячей и в фильтрате открывают альбумозы и пептоны, а затем открывают свободный триптофан, для чего 3-5 мл гидролизата нейтрализуют уксусной кислотой, добавляют 1 мл амилового алкоголя и затем по каплям свежеприготовленную бромовую воду. Хорошо встряхивают. В присутствии триптофана слой амилового алкоголя окрашивается в красно – фиолетовый цвет.

Избыток бромной воды обесцвечивает образующееся окрашенное соединение. Реакцию можно вести также не употребляя амилового алкоголя.

2. Открытие свободных аминокислот методом распределительной хромотографии.

Принцип метода заключается в том, что подвижный растворитель смачивая с одного конца полоску фильтровальной бумаги, поднимается и увлекает за собой аминокислоты, которые были нанесены на бумагу. Неподвижной жидкой фазой является вода воздушносухой фильтровальной бумаги, на которую наносят каплю р-ра аминокислот подвижной – растворитель.

Аминокислоты движутся с разной скоростью вследствие того, что неодинаково растворяются в воде и растворителе. Чем выше растворимость аминокислоты в воде, тем меньше она продвинется в направлении движения растворителя и наоборот, чем больше растворяется она в растворителе, чем дальше она поднимается от места нанесения. После продвижения растворителя по длине полосы бумагу высушивают и смачивают р-ром реактива, который с аминокислотами дает цветную реакцию. На бумаге появляются цветные пятна, соответствующие отдельным аминокислотам. Положение пятна, т.е. отношения расстояния его середины от места нанесения испытуемой смеси к расстоянию

фронта растворителя от места нанесения смеси, характерно для каждой кислоты. Эта величина называется коэффициентом распределения. Коэффициент распределения характерен для определенной аминокислоты только в определенных условиях (температуры, сорта бумаги, и растворителя). Для обнаружения аминокислот берут полоску фильтровальной бумаги (шириной 2-2.5 см, длиной 20-25 см). На одном конце, на расстоянии 5-7 см от края, делают простым карандашом кружок диаметром около 5 см, на который наносят капилляром маленькую каплю раствора аминокислот и высушивают ее на воздухе. Полоску бумаги 3 кнопками прикалывают к пробке, которой затем закрывают цилиндр. В цилиндр наливают насыщенного водой фенола столько, чтобы конец бумаги, на который и нанесена капля был погружен в жидкость на 1-2 см; пробку плотно закрывают. Полоска бумаги не должна касаться стенок цилиндра. Цилиндр помещают в термостат на 35-40 °C.

Бумага постепенно смачивается фенолом, когда фронт жидкости пройдет расстояние 10-12 см бумагу вынимают и высушивают в сушильном шкафу при 100°C. Сухую бумагу опрыскивают р-ром нингидрина и вновь подсушивают в сушильном шкафу в течение 5-6 минут, на бумаге появляется сияние пятна. Измеряют расстояние от места нанесения испытуемого раствора до фронта растворителя и до середины пятен. Вычисляют коэффициент распределения для аминокислот.

Оформить отчет в тетради.

Лабораторная работа № 3

«Цветные реакции на белки»

Цель работы: Ознакомиться с методикой определения цветных реакций на белки.

Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.

Ход работы:

Поиск по сайту: