Исследование белкового состава мяса для установления его видовой принадлежности (методами изоэлектрофокусирования и вертикального SDS–электрофореза)

При помощи электрической мясорубки дважды измельчают 200 г исследуемой вареной колбасы, и полученный фарш тщательно перемешивают. Затем из разных участков фарша отбирают три пробы по 2 г, и от каждой пробы берут навески по 300 мг (всего три навески). Каждую навеску помещают в полиэтиленовые микропробирки и добавляют по 1 см³ солюбилизирующего буфера. Сравнительные образцы сои и казеината натрия готовят в концентрации 1 мг на 1 см³ буфера. После этого микропробирки с образцами помещают на 5—7 мин в кипящую водяную баню, периодически встряхивая и перемешивая содержимое. После экстракции на водяной бане образцы центрифугируют 5—10 мин при режиме работы центрифуги 10 000 об/мин. Для концентрирования белков в узких зонах к 200 мкл надосадочной жидкости (для сравнительных образцов — к 5 мкл надосадочной жидкости) добавляют 20 мкл водного раствора сахарозы. Полученную смесь в количестве 4—5 мкл при помощи микрошприца подслаивают под солюбилизирующий буфер в «карманы» геля. Вместе с образцом в «карманы» гелевой пластины вводят окрашивающий реагент — Бромфенол синий, 0,04%-ный водный раствор. В нижнюю и верхнюю камеры прибора наливают разделяющий трис-глициновый буфер (раствор № 4), разведенный в 10 раз. Затем включают систему охлаждения (температура воды не должна превышать 10—12° С) для поддержания в электрофоретической камере постоянной температуры. Прибор подключают к источнику питания и устанавливают режим напряжения 100 В (25 мВ) на 30 мин. После этого напряжение повышают до 200 В (60 мА). В таком режиме электрофоретическое разделение проходит в течение 4—5 ч. Затем гелевую пластину обрабатывают фиксирующим и обесцвечивающим растворами, после чего окрашивают по стандартной методике с помощью красителя Кумаси-голубого R – 250. На электрофореграммах выявляют характер распределения белковых компонентов и дифференциацию белков в индивидуальных зонах в виде полос синего цвета. Результаты оценки фореграмм основываются на выявлении в общей системе белков вареных колбас маркерных (характерных только для данного вида) белков сои и казеината натрия. Как правило, на фореграмме рядом с исследуемыми образцами вареных колбас в качестве «свидетелей» вводят образцы чистых белков соии казеината натрия, подготовленные аналогично исследуемым образцам. Визуальное сопоставление фореграмм позволяет определить, какие именно белки являются маркерными. Именно маркерные белки способствуют точной дифференциации белков вареных колбас, сои и казеината натрия. Использование метода SDS -электрофореза позволяет разделить сложную белковую структуру вареных колбас более чем на 20 белковых зон. Это позволяет достоверно установить местоположение маркерных белков сои и казеината натрия. Образцы соевых белков (изолятов и концентратов), исследованные методом SDS -электрофореза имеют один и тот же белковый состав независимо от способа их производства. Анализ полученных фореграмм белковых добавок позволяет выявить характерные белки сои и казеината натрия, отличающиеся от белков мяса. Например, в случае вложения в колбасный фарш соевого белка или казеината натрия на фореграмме в свободной зоне проявятся соответствующие маркерные белки.

Поиск по сайту: