Реакции Балласа и Подобедова

К 1 мл р-ра белка осторожно по стенке пробирки добавляют 2 капли 10% спиртового раствора альфа-нафтол и концентрированной серной кислоты, стараясь не смешивать жидкость. Фиолетовое кольцо, получающееся на границе двух слоев, указывает на присутствие углеводной группы в белковой молекуле.

Оформить отчет в тетради.

Лабораторная работа № 4

«Обратимое и необратимое осаждение белков»

Цель работы: Ознакомиться с методами осаждения белков.

Материальное обеспечение и реактивы:

Белок куриного яйца, уксусная кислота 1% р-р, конц. Азотная кислота, конц. Серная кислота, конц. соляная кислота, пикриновая кислота, танин, 5% железистосинеродистый калий, 10% р-р фосфорновольфрамовой или фосфорномолибденовой кислоты, водный р-р 2% лимонной кислоты, 1 % р-р пикриновой кислоты, насыщенный р-р йодной ртути в 5 % р-ре йодистого калия, 5 % р-р сернокислой меди или сернокислого цинка, 5 % р-р едкого натра, каолин, спирт, хлористый натрий, сернокислый аммоний (насыщ.), сернокислый магний, 10 % р-ры хлористого натрия и сернокислого магния, стаканы, пробирки, пипетки на 2, 5, 10 мл, фильтровальная бумага, воронки.

Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.

Ход работы:

Переход из состояния золя в состояние геля, т.е. коагуляция (осаждение) белкового золя может быть обратимым, если полученный гель способен снова перейти в золь, или необратимым, когда такой обратный переход невозможен. В последнем случае имеет место процесс денатурации белка и полученный осадок является денатурированным протеином. Белковые золи наименее стойкие и наиболее легко коагулируют при изоэлектрическом состоянии белкового амфолита, т.е. при [H], соответствующей изоэлектрическому пункту данного белка.

Реакции осаждения имеют большое значение, прежде всего для качественного открытия белковых веществ. Некоторые из них имеют так же значения для количественного осаждения белков. Наконец, те реакции осаждения, которые представляют собой обратимое изменение состояния белков, служат для их выделения и разделения.

1. а) Осаждение при нагревании кислотами. Р-р белка нагревают до кипения, причем происходит коагуляция. Параллельно нагревают р-р белка, подкисленный 1-2 каплями 1% уксусной кислоты. При этом происходит более полное осаждение белка.

Нагревают до кипения сначала сильно подкисленный, а затем сильно подщелоченный р-р белка. Осаждение не наблюдается, т.к. в этих условиях образуются продукты неглубокого гидролиза белка: кислотный и щелочной альбуминаты.

б) Осаждение кислотами. При осторожном добавлении к р-ру белка концентрированной азотной кислоты на границе жидкостей образуется белый хлопьевидный осадок. Эту же пробу повторяют с концентрированной серной и соляной кислотами.

2. Осаждение алкалоидными реактивами.

а) Пикриновая кислота. Добавляют к раствору белка, подкисленного уксусной кислотой, несколько капель насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образуется желтоватый осадок.

б) Танин. При добавлении раствора танина к подкисленному уксусной кислотой р-ру белка выделяется сероватый осадок.

в) Железистосинеродистый калий. К подкисленному уксусной кислотой р-ру белка добавляют по каплям 5%-ый р-р железистосинеродистого калия K₄Fe(CN)₆. Выделяется осадок.

г) Фосфорновольфрамовая и фосфорномолибденовая кислоты. Осаждают белок, добавляя к белковому раствору 10% р-р фосфорновольфрамовой или фосфорномолибденовой кислоты.

д) Трихлоруксусная и сульфоциловая кислоты. Белок осаждают, добавляя к белковому раствору несколько капель 10% раствора трихлоруксусной кислоты или равный объем 20% р-ра сульфоциловой кислоты.

е) Водный р-р 2% лимонной кислоты и 1% р-р пикриновой кислоты, и насыщенный раствор водной ртути в 5% йодистом калии. Осаждают белок добавление реактива или добавлением к подкисленному соляной кислотой белковому раствору реактива.

3. Осаждение гидратами окисей цинка и меди и каолином. К раствору белка добавляют 5% р-р сернокислой меди или сернокислого цинка и затем по каплям 5% р-р едкого натра до полного осаждения. Отфильтровывают полученные осадки и исследуют фильтрат на отсутствие белка посредством одной из вышеперечисленных реакций. Р-р белка подкисляют уксусной кислотой, добавляют половину объему каолина и встряхивают несколько минут. Отфильтровывают осадок и проверяют полноту осаждения нагреванием и реакциями с алкалоидными реактивами.

4. Осаждение алкоголем и нейтральными солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание). При смешивании р-ра белка с избытком алкоголя выделяется осадок. Осаждение это обратимо при условии, если оно ведется при достаточно низкой температуре (лучше всего около 0°C) и не слишком длительном воздействии алкоголя.

К р-ру яичного белка добавляют тонко измельченный твердый хлористый натрий до полного насыщения. При этом выпадает осадок глобулина. Его отфильтровывают, и к фильтрату добавляют твердый измельченный сернокислый аммоний до полного насыщения. Выпадает осадок альбумина. К раствору белка добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. При этом (полунасыщение) выпадает осадок глобулина. Его отфильтровывают и к фильтрату добавляют твердый измельченный сернокислый аммоний до полного насыщения. Выпадает осадок альбумина. К раствору белка добавляют до полного насыщения твердый сернокислый магний. При этом выпадает глобулин. Его отфильтровывают и в фильтрате обнаруживают присутствие белка (альбумина) нагреванием и одной из проб с алкалоидными реактивами.

Для того чтобы убедиться в обратимости осаждения солями, полученные осадки белков растворяют в воде (альбумины) или в 5-10% р-рах хлористого натрия сернокислого магния и других солей (глобулины).

Оформить отчет в тетради.

Лабораторная работа № 5

«Исследования специфичности ферментов. Определение влияния температуры и концентрации ионов водорода на активность ферментов»

Цель работы: Изучение специфичности ферментов и влияние на них температуры и концентрации ионов водорода.

Материальное обеспечение: Пробирки, пипетки на 2.5 мл, электрические плитки, водяная баня, pH – метр.

Реактивы: 1% р-р крахмала, р-р йода в йодистом калии, 2 % р-р сахарозы, водяная вытяжка из растертых с песком пекарских дрожжей, реактив Фелинга, лимонно- фосфатные буферные смеси.

Формирование компетенций: ОК-1, ОК-4, ПК-1.1, ПК-1.2, ПК-2.2, ПК-6.1.

Ход работы:

С повышением температуры скорость ферментных реакций увеличивается, после достижения температурного оптимума она начинает снижаться и, наконец, реакция прекращается совсем. Оптимальной температурой для большинства ферментов животного происхождения является 37°C. При 100°C все ферменты теряют каталитические свойства, а многие при более низких температурах.

Влияние ферментов на активность амилазы слюны.

Слюну разбавляют водой, часть жидкости кипятят, отлив в пробирку; амилаза слюны при этом необратимо инактивируется. В 2 пробирки приливают по 5 мл 1% р-ра крахмала и затем в одну из них добавляют не прокипяченную, а в другую прокипяченную слюну. Обе пробирки ставят на водяную баню при 37°C и через 15 минут в каждую из них прибавляют по 1-2 капли раствора йода в йодистом калии.

В пробирке с не прокипяченной слюной синяя окраска не проявляется, т.к. крахмал под действием амилазы расщепился. В пробирке с прокипяченной слюной появляется синяя окраска, обусловленная присутствием крахмала. Крахмал в последнем случае не расщепился, т.е. амилаза инактивирована кипячением.

Специфичность ферментов:

Ферменты характеризуются высокой специфичностью действия. Например, фермент амилаза расщепляет крахмал, но не действует на другой углевод – сахарозу.

Для этой работы в 4 пробирки помещают: 1 - крахмал и амилазу: 2 – крахмал и фруктофуранозидазу: 3 – сахарозу и фруктофуранозидазу: 4 – сахарозу и амилазу.

Пробирки встряхивают и ставят на водяную баню при 37°C на 15 минут, после чего в каждую пробирку добавляют реактив Фелинга и нагревают. В пробирках 1 и 3 появляется красный осадок, что свидетельствует о расщеплении крахмала под действием амилазы, и сахарозы под действием фруктофуранозидазы. В пробирках 2 и 4 реакция отрицательна. Это показывает, что крахмал не расщепился фруктофуранозидазой, а сахароза – амилазой.

Крахмал и сахароза дают отрицательную реакцию Фелинга, т.к. не обладают всасывающими свойствами. При ферментативном гидролизе крахмала образуется дисахарид – мальтоза, при гидролизе сахарозы – моносахариды: глюкоза и фруктоза. Мальтоза, фруктоза и глюкоза содержат свободные карбонильные группы и поэтому обладают способностью восстанавливать окисную медь, входящую в состав реактива Фелинга, в закисную медь, при нагревании образующую осадок красного цвета.

Поиск по сайту: