Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу бета-глицерофосфата (метод Бодански)

Принцип метода. Под действием фермента сыворотки крови бета-глицерофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора, по содержанию которого и судят об активности данного энзима.

Ход работы. В 4 пробирки (2 опытные — для исследования активности щелочной и кислой фосфатаз и 2 контрольные — для установления содержания в сыворотке неорганического фосфора) приливают по 1 мл соответствующего (щелочного и кислого) раствора бета-глицерофосфата. Первые 2 пробирки на несколько минут помещают в водяную баню или термостат (37°С) с целью прогревания раствора субстрата. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки вносят по 0,1 мл свежевзятой сыворотки и полученную фермент-субстратную смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Учитывая, что активность кислой фосфатазы в «нормальной» крови обычно весьма незначительна, иногда гидролиз соответствующей пробы проводят три часа; цифру, выражающую результат, делят на 3.

Время термостатирования опытных проб может быть использовано для определения содержания неорганического фосфора в контрольных пробах. Для этого к 1 мл щелочного (или кислого) раствора бета-глицерофосфата приливают 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавляют 0,1 мл той же сыворотки; пробы взбалтывают и через несколько минут фильтруют или центрифугируют.

К 1,5 мл отобранного фильтрата (центрифугата) доливают 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, пробы выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют в красной области спектра, например, на ФЭКе с красным светофильтром в кювете с шириной слоя 5 мм. При учете оптической плотности проб в качестве раствора для сравнения используют дистиллированную воду (вместо нее лучше ставить пробу на реактивы, содержащую бета-глицерофосфат).

Рассчитывают активность щелочной и кислой фосфатаз по калибровочной кривой.

Активность фосфатазы ранее выражали количеством мг неорганического фосфора, образующегося в результате деятельности всей фосфатазы, заключенной в 100 мл сыворотки (единицы Бодански). Для этого по калибровочной кривой находили уровень неорганического фосфора в опытных (Оп_щ и Оп_к) и контрольных (К_щ и К_к) пробах. Затем, вычтя из показателей содержания неорганического фосфора в опытных пробах содержание его в контрольных пробах, определяли количество фосфора (мг), которое освободилось при деятельности фосфатазы, заключенной в 0,1 мл сыворотки. Очевидно, что под влиянием ферментативной активности фосфатазы, содержащейся в 100 мл сыворотки, неорганического фосфора выделилось бы в 1000 раз больше.

Отсюда активность щелочной (1) и кислой (2) фосфатаз рассчитывают по следующим формулам:

(Оп_щ - К_щ) • 1000 = а ед. Бодански (1), (Оп_к - К_к) • 1000 = а ед. Бодански (2),

где Оп_щ, Оп_к (К_щ, К_к) — количество неорганического фосфора, содержащегося в опытных (и контрольных) пробах, 1000 — коэффициент пересчета, а — количество единиц Бодански (ВЕ).

В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке взрослых людей составляет 2—5 ед, у детей — 5—12 ед Бодански. Активность кислой фосфатазы в сыворотке крови взрослых и детей колеблется в пределах от 0,1 до 0,55 ед Бодански.

Приведенный способ выражения активности фосфатаз (в ед Бодански) является устаревшим. В соответствии с требованиями используемой в клинико-лабораторной практике Международной системы единиц активность этих ферментов следует оценивать по количеству выделенного неорганического фосфора (в ммоль) при действии на субстрат 1 л сыворотки за время инкубации 1 ч при +37°С. Пересчет производится по формуле:

а • 474,19.

В норме активность щелочной фосфатазы составляет у взрослых 0,5—1,3 ммоль/(ч*л), кислой фосфатазы — 0,05—0,13 ммоль/(ч*л).

Примечание: не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 ч после массажа простаты или ее инструментального исследования.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Клинико-диагностическое значение определения активности фосфатаз

Повышение активности щелочной фосфатазы в крови происходит главным образом при двух видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролиферацией остеобластов, и болезнях, сопровождающихся явлениями холестаза.

Путем определения активности щелочной фосфатазы удается выявить скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании детей — и предрахитические стадии заболевания. Повышение активности фосфатаз в данном случае надо рассматривать как компенсаторный механизм обеспечения потребностей орга­низма в неорганических фосфатах.

У больных с опухолями костей без новообразований костной ткани (остеомы, хондромы, гигантоклеточная опухоль, множественная миелома и др.) активность щелочной фосфатазы не изменяется. Не повышается активность фермента в крови также при деструктивном характере повреждения костей.

Метастазирование опухолей в кости приводит к возрастанию активности щелочной фосфатазы сыворотки крови. Но еще больший подъем активности фермента наблюдается при метастазировании в печень.

Повышение активности ЩФ происходит не только в условиях интенсивного роста костной ткани, но и при ее разрушении: остеопорозе и последующей остеомаляции. Прямое подтверждение этого процесса, к сожалению, возможно только путем биопсии костной ткани. При тяжелом остеопорозе, остеомаляции активность ЩФ в сыворотке крови может быть нормальной или слабоповышенной (в 2—3 раза). Остеомаляция, верифицированная гистологически, может протекать при нормальной активности ЩФ.

Активность ЩФ в сыворотке крови бывает повышена при остеомиодистрофии, развивающейся как осложнение длительного гемодиализа.

У пациентов с болезнью Педжета отмечена достоверная корреляция активности ЩФ и степени поражения скелета. При остеопорозе показана прямая зависимость активности ЩФ крови и экскреции с мочой оксипролина. В этих условиях определение активности ЩФ сыворотки крови можно использовать для оценки эффективности терапии кальцитонином и фосфатами.

При заболеваниях печени, сопровождающихся повреждением паренхимы и острым клеточным некрозом печени (вирусный гепатит, саркоидоз, туберкулез, амилоидоз и лимфогранулематоз, инфекционный мононуклеоз), отмечается умеренное возрастание активности ЩФ. Особенно резкое повышение ее активности встречается при желтой атрофии, абсцессах печени, а также поражениях печени, вызванных некоторыми лекарственными веществами: хлорпромазином, метилтестостероном.

Увеличивается активность щелочной фосфатазы также при обтурационной (механической) желтухе, возникшей вследствие закупорки внутри- и внепеченочных желчных протоков камнем, спайками, опухолью (рак гепатодуоденальной зоны). Кроме освобождения печеночного изофермента ЩФ, холестаз обусловливает также попадание желчного фермента в плазму крови через синусоиды, а также вследствие активации фермента в желчных канальцах. Этим комбинированным эффектом и объясняется высокая чувствительность щелочной фосфатазы к закупорке желчных путей.

Возрастание активности фермента часто наблюдается при холангите и холангиолите, хроническом холецистите.

Исследование активности ЩФ оказывается полезным и в дифференциальной диагностике внутри- и внепеченочного холестаза. В случае экстрагепатобилиарной обструкции при камнях желчного протока и желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается в 10 раз и более. Внутрипеченочная обструкция желчных путей при гепатите также сопровождается повышением активности ЩФ, но степень гиперферментемии не превышает 2—3-кратного значения. Острые некротические изменения гепатоцитов могут не сопровождаться повышением активности ЩФ до тех пор, пока в патологический процесс не будут вовлечены желчные канальцы и не будет происходить задержка желчеотделения. В то же время далеко не во всех случаях поражения паренхимы печени имеется четкая корреляционная зависимость между активностью ЩФ сыворотки крови и содержанием в ней билирубина. В начале развития внутрипеченочного стаза повышение активности ЩФ может быть следствием усиления синтеза белка в гепатоцитах; последующее возрастание активности ЩФ в сыворотке крови, особенно в форме макро-ЩФ, связано с нарушением целостности клеток желчных канальцев.

ЩФ высокой молекулярной массы, присутствующая в сыворотке крови больных внутри- и внепеченочным холестазом, представляет собой комплекс фермента с фрагментами плазматической мембраны гепатоцитов, составляющих синусоидальную зону печени. Методом электронной микроскопии установлено, что ЩФ в крови больных, страдающих холестазом, представляет собой везикулы трехслойной структуры. Помимо ЩФ, эти фрагменты плазматической мембраны содержат и другие мембрано-связанные ферменты — гамма-глутамилтранспептидазу, лейцин-аминопептидазу, 5-нуклеотидазу. Специфичный для холестаза липопротеин, названный ЛП-Х, рассматривается как специфичный тест холестаза.

Ассоциация фермента ЩФ с ЛП-Х дала основание назвать такой комплекс холестатическим, хотя более правильно для ЩФ высокой молекулярной массы оставить термин «мембраносвязанный комплекс ЩФ». Он является более чувствительным индикатором ранних сроков холестаза по сравнению с другими тестами.

Повышение активности ЩФ в сыворотке крови отмечено бо­лее чем у 30% больных ревматоидным артритом, однако не найдено корреляции общей активности ЩФ с длительностью заболевания, возрастом, полом и скоростью седиментации эритроцитов. Более высокая по сравнению с нормой активность ЩФ выявлена при ревматоидных васкулитах, гранулематозах и полиартрите, что связывают с вовлечением в процесс гепатобилиарной системы. Тем не менее повышение активности печеночного изофермента ЩФ при ревматизме не связано со степенью тяжести патологического процесса. Следует принять во внимание, что даже терапевтическая доза противовоспалительных препаратов, например салицилатов, приводит к повышению активности аминотрансфераз и ЩФ в сыворотке крови. Изучение спектра изоферментов ЩФ при ревматизме показало, что повышение активности «костного» изофермента в более высокой степени, чем общая активность фермента, коррелирует с клиникой болевого синдрома при анкилозируюшем спондилите.

Активность ЩФ увеличивается при некоторых заболеваниях кишечника: язвенном колите, регионарном илеите, кишечных инфекциях. Повышение ее отмечено и при заболеваниях мышц, карциноме легких, фиброаденоме молочной железы и «почечном рахите».

Лейкемия, в большей степени миелоидная, сопровождается умеренным возрастанием активности щелочной фосфатазы крови. По-видимому, при ней имеет место выход фермента из разрушающихся лейкоцитов в кровь.

Активность ЩФ в сыворотке крови повышается при беременности, достигая максимума к моменту родов; щелочную фосфатазу вырабатывают микроворсинки трофобластической мембраны. Это позволяет расценивать показатель активности ЩФ как тест оценки состояния плаценты при беременности.

Снижение активности щелочной фосфатазы в крови возникает при ослаблении остеобластических процессов, например, при замедленном росте у детей.

Активность ЩФ сыворотки крови уменьшается при гипотиреозе, авитаминозе С (цинге), старческом остеопорозе, выраженной анемии, квашиоркоре, ахондроплазии, кретинизме, состояниях, связанных с накоплением радиоактивных веществ в костях

Понижение активности отмечается при хронической миелоидной лейкемии и при некоторых гепатологических заболеваниях.

Повышение активности ЩФ в лейкоцитах (сосредоточена в нейтрофилах), выявляемое чаще всего методами цитохимии, отмечается при синдроме Дауна и, по-видимому, связано с нарушениями в 21-й хромосоме.

Содержащийся в плазме крови фермент с молекулярной массой 110 000 Д не фильтруется патологически неизмененными клубочками почек. В связи с этим в норме моча содержит лишь следы активности щелочной фосфатазы.

Повышение активности ЩФ в моче отмечается после травматического повреждения почек или их заболевания. Полагают, что это почечный фермент, подвергшийся модификации в моче. Источником высокой фосфатазной активности экскрементов, видимо, является слизистая оболочка кишечника.

Повышение активности КФ, в большом количестве содержащейся в предстательной железе, при нормальном уровне ЩФ указывает на новообразования в этой железе.

Возрастание активности КФ наблюдается через 1—2 сут после оперативного вмешательства на предстательной железе (а также при ее биопсии).

Активность КФ значительно увеличивается при повышенном разрушении тромбоцитов, тромбоэмболиях, гемолитических состояниях, поражении костей метастазами опухолей, иногда при миеломной болезни.

Возрастание активности КФ сопровождает болезни почек, поражения гепатобилиарной системы, системы фагоцитирующих мононуклеаров.

Замечено, что активность ревматического процесса коррелирует с возрастанием активности кислой фосфатазы в сыворотке крови. Наиболее высокая активность фермента наблюдается у больных с затяжным и непрерывно рецидивирующим процессами. Этот тест может быть применен для оценки эффективности гормональной терапии и выявления малоактивных форм ревматического процесса с неблагоприятным течением.

Лихорадочное состояние также может, привести к ложному повышению данного показателя.

Лабораторная работа № 2.

Поиск по сайту: