Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку)

Принцип метода. L-лактат в щелочной среде в присутствии ЛДГ сыворотки и добавленного НАД окисляется в пируват. По степени его образования и судят об активности фермента.

Ход работы.

0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД и прогревают 5 мин при 37°С. Затем добавляют 0,8 мл раствора пирофосфорнокислого натрия и 0,2 мл раствора молочнокислого натрия, предварительно прогретых при 37°С. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15 мин. Тотчас же после инкубации в пробу доливают 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают ее 20 мин при комнатной температуре. Затем вносят 5 мл раствора едкого натра, содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин измеряют абсорбцию в области длин волн 500—560 нм, например на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. Регистрируют показатели оптической плотности исследуемой пробы, учитывая абсорбцию контрольной.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но разведенную 1:2 сыворотку добавляют после инкубации смеси. Рассчитывают активность фермента по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в ммоль пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 л сыворотки в течение 1 ч при 37°С. Нормальные величины активности общей ЛДГ в сыворотке крови — от 0,8 до 4 ммоль/ч • л.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Клинико-диагностическое значение определения общей активности ЛДГ

В связи с тем, что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов.

Повышение активности лактатдегидрогеназы. Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией (гемолитической, пернициозной, мегалобластной, серповидно-клеточной), обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках).

При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови увеличена в первые недели желтушного периода. Активность энзима значительно повышается при разнообразных формах хирургической патологии, сопровождающихся шоковым состоянием, выраженной гипоксией, декомпенсацией сердечно-сосудистой деятельности.

У больных инфарктом миокарда активность фермента в сыворотке крови повышалась через 8—10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24—28 ч, оставалась увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8—9-м сут. Характерно, что общая активность сывороточной ЛДГ у больных инфарктом миокарда сохранялась повышенной вдвое дольше, чем активность других ферментов. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда. У больных со стенокардией активность ЛДГ в сыворотке крови не увеличивалась. Общая активность ЛДГ у больных острым крупноочаговым инфарктом ми­окарда значительно повышалась уже в 1-е сут заболевания. Максимальный уровень ЛДГ (превышающий норму в 4—5 раз) наблюдался на 2-е сут, активность фермента оставалась высокой на 3-й, 4-е и 7-е сут, даже на 15-е сут заболевания она была достоверно выше, чем в контрольной группе. Установлена достоверная прямая корреляционная связь между размером очага омертвения в миокарде и общей активностью ЛДГ. Исследование общей активности ЛДГ имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение. При мелкоочаговом инфаркте миокарда сдвиг активности ЛДГ умеренный. При высоком уровне ЛДГ следует опасаться неблагоприятного исхода заболевания, так как это обычно свидетельствует о наличии обширного, нередко трансмурального инфаркта миокарда. Следует отметить, что увеличение общей активности ЛДГ наблюдается не только при остром инфаркте миокарда, но также гемолизе любого происхождения (in vivо и in vitrо), анемии (гемолитической, пернициозной, серповидноклеточной, мегалобластной), остром некрозе почек. При желчнокаменной болезни без обтурации желчных ходов повышения активности ЛДГ не отмечено, тогда как у больных обтурационной желтухой на почве новообразования, билиарным циррозом, с опухолями поджелудочной железы она резко увеличена. То же наблюдается при желчном перитоните, когда в патологический процесс вовлекается печень.

К увеличению общей активности ЛДГ приводит прием алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона.

Снижение активности лактатдегидроганазы. Существует две группы причин, обусловливающих сниже­ние активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая — с генетическими нарушениями. Действительно, в сыворотке крови даже практически здоровых взрослых людей существует термозависимый ингибитор, присутствие которого снижает активность ЛДГ. При исследовании 20 000 образцов сыворотки крови выявлено 42 случая низкой активности ЛДГ. В качестве ингибиторов активности фермента крови выступают IgG, IgА, IgM.

Уменьшение активности ЛДГ вызывают оксалаты (используемые в качестве антикоагулянтов) и мочевина.

Лабораторная работа № 3.

Поиск по сайту: