Морфология дрожжей

Дрожжи ‑ одноклеточные, неподвижные, не образующие мицелия микроорганизмы, относящиеся к сумчатым плесневым грибам класса Аскомицетес (Ascomycetes). Форма дрожжевых клеток чаще всего овальная, яйцевидная или эллипсовидная. Реже встречаются дрожжи палочковидные и лимонообразные. По своим размерам это довольно крупные микроорганизмы: длина клетки 5-12 мкм, ширина 2-6 мкм. Дрожжевые клетки имеют клеточную оболочку, протоплазматическую мембрану, протоплазму и ясно выраженное ядро. У молодых клеток протоплазма тонкозернистая, по мере старения образуются вакуоли, заполненные клеточным соком. В качестве запасных питательных веществ в протоплазме могут быть включения гликогена, волютина и капельки жира. В некоторых дрожжевых клетках количество жира достигает 30-50% их массы. Такие дрожжи используются в производстве для дрожжевания кормов. Кроме того, дрожжи ‑ хорошие продуценты белка и витаминов, например, комплекса витаминов группы В, витамина Д.

Размножаются дрожжи почкованием, спорообразованием и простым делением.

У спорообразующих видов дрожжей можно наблюдать под микроскопом споры различной формы: округлые, овальные и др. Обычно в клетках содержатся несколько спор (рис. 5).

Классификация дрожжей

Дрожжи и дрожжеподобные грибы относятся к сумчатым, базидиомицетам и несовершенным грибам ‑ Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes.

Рис. 4. Дрожжи:

а-хлебные, б-винные, г-кефирные, д-спорообразующие.

В класс Ascomycetes входит порядок Endomycetales ‑ дрожжеподобные сумчатые грибы, образующие эндоспоры. К этому порядку относятся семейства Saccharomycetaceae ‑ дрожжи, размножающиеся почкованием; Schizosaccnaromycetaceae ‑ дрожжи, размножающиеся делением.

Saccharomicodoceae ‑ лимонновидные дрожжи, размножение которых начинается по типу почкования, а заканчивается по типу деления, К семейству Saccharomycetaceae принадлежит хорошо изученный род Saccharomyces (сахаромицес), к которому относится большинство культурных дрожжей, применяемых в промышленности. Дрожжи этого рода размножаются почкованием и способны к спорообразованию. Отдельные их виды различаются способностью сбраживать те или иные сахара, интенсивностью брожения, количеством образуемого спирта, оптимальными температурами почкования и образования спор и другими признаками. Два вида этого рода наиболее широко применяют в промышленности.

Sacch. сerevisiae ‑дрожжи округлой или овальной формы; используются в производстве этилового спирта, пивоврении, квасоварении и хлебопечении; в различных отраслях применяются свои расы дрожжей; Sacch. ellipsoideus (S. Vini) ‑ дрожжи эллипсоидной формы, применяются преимущественно в виноделии; этот вид также представлен многими расами.

Некоторые другие виды рода Saccharomyces, нередко называемые дикими дрожжами, являются возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Класс Basidiomycetes представлен дрожжами, образующими половые структуры базидиального типа (базидиоспоры). Большая часть этих дрожжей родственна головневым грибам.

К классу Deuteromycetes относятся дрожжеподобные организмы, не образующие эндоспор. Они размножаются почкованием. Интерес представляют роды кандида (Candida), родоторула (Rhodotorula) и торулопсис (Torulopsis). Представители их широко распространены в природе, они аэробы, многие вызывают порчу различных продуктов: вин, пива, пекарских дрожжей, квашеных овощей, безалкогольных напитков и многих других продуктов.

Имеются виды дрожжей рода Candida, вызывающие заболевания (кандидозы) у людей, при этом поражаются слизистые рта и других органов. Есть и полезные виды рода Candida, они широко применяются в микробиологической промышленности: используются при получении белково-витаминного препарата, органических кислот, многоатомных спиртов; представители этого рода принимают участие в очистке сточных вод, являясь компонентами активного ила, участвуют в очистке почвы и морской воды от нефтяных загрязнений. Дрожжи р. Candida размножаются многосторонним почкованием, большинство видов образуют псевдомицелий. Псевдомицелий часто бывает дифференцирован на псевдогифы и бластоспоры. Бластоспорами у дрожжей называют вегетативные споры, образующиеся путем почкования на псевдомицелии. Они обычно круглой или овальной формы и располагаются по отношению к псевдомицелиальным клеткам в определенном порядке, образуя или цепочки, или мутовки.

К несовершенным грибам относятся также широко распространенные в природе виды дрожжей р. Rhodotorula, отличающиеся желтой или красной окраской за счет содержания каротиноидов. Их применяют для обогащения полученной биомассы провитамином А.

Дрожжи рода Torulopsis имеют круглую или овальную форму. Многие вызывают лишь слабое спиртовое брожение. Отдельные виды используют в производстве кумыса и кефира. Виды кандида используются в производстве кормовых дрожжей для нужд животноводства и птицеводства.

Определение размеров микробной клетки

Величину микроорганизмов измеряют под микроскопом, пользуясь окулярной линейкой (микрометром). Микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована шкала с делениями (50 или 100). Окуляр-микрометр помещают в окуляр делениями вниз, предварительно отвинтив глазную линзу. После завинчивания линзы окуляр вставляют в монокулярную насадку микроскопа.

Работа начинается с определения цены деления окуляра микрометра при данном увеличении микроскопа. Для этой цели служит дополнительное приспособление ‑ объект-микрометр, который представляет собой стеклянную пластинку (иногда в металлической оправе) с линейкой в центре. Эта линейка имеет длину 1 мм и разделена на 100 делений, каждое из которых равно 0,01 мм (10 мкм). Объект-микрометр помещают на предметный столик и фокусируют с тем объективом, при котором будут определять размеры клеток. Вращая окуляр и перемещая объект-микрометр, совмещают нулевую черту окуляра-микрометра с любой чертой объекта-микрометра, после чего находят следующее совмещение (рис. 5). Вычисляют, скольким делениям объекта-микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра. Предположим, два деления объекта-микрометра (20 мкм) соответствуют пяти делениям окуляра-микрометра, следовательно, величина (цена) деления окуляра-микрометра равна 4 мкм (20:5). Зная величину деления окуляра-микрометра, приступают к определению величины микроорганизмов при том же увеличении. С этой целью измеряют, какому числу делений окуляра-микрометра соответствуют длина и ширина клетки, и умножают полученные числа на цену деления окуляра. Для достоверности результата необходимо измерить не менее 20 клеток и получить средние размеры.

Рис. 5. Определение цены деления окуляра-микрометра

Самостоятельная работа

1. Изучение морфологии клеток винных, пекарских и диких дрожжей в препарате "раздавленная капля". Определение относительного количества живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах.

2. Изучение содержания включений в дрожжевой клетке:

а) изучение содержания гликогена;

б) обнаружение жира;

в) обнаружение волютина.

3. Определение размера дрожжевой клетки одной из культур.

4. Оформление протокола исследования.

Методические указания

РАЗДЕЛ 1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ДРОЖЖЕЙ

Для микроскопирования дрожжей следует приготовить препарат "раздавленная капля" из чистых культур дрожжей ‑ винных, пекарских и диких. Приготовленные препараты изучить под микроскопом со средним увеличением (с объективом х40). При этом необходимо рассмотреть, прежде всего, форму клетки и ее строение, обратить внимание на клеточную оболочку, цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма при микроскопировании представляет собой темную зернистую массу, вакуоли и капли жира в виде светлых (блестящих) пятнышек, гликоген ‑ в виде уплотненных зерен. Необходимо убедиться в неподвижности дрожжевых клеток.

Затем изучают способы бесполого размножения дрожжей. Для этого нужно отыскать в поле зрения микроскопа почкующиеся клетки. Все препараты зарисовать при работе с объективом х40. На рисунках обозначить анатомическое строение дрожжевых клеток, почкующиеся клетки. В выводе указать отличие изученных препаратов дрожжей по форме.

Определить относительное количество живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах ‑ старых и подмоложенных. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю слабого раствора (1:1000) метиленового синего, размешать, накрыть покровным стеклом. Мертвые клетки прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки. Препарат зарисовать в цвете.

РАЗДЕЛ 2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЙ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме клеток могут формироваться морфологические образования, представляющие собой либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещества. Включения различны по своей химической природе. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и могут использоваться в метаболизме клетки.

Клеточные включения могут выявляться цитохимическими методами.

а). Определение полисахаридов (гликогена и гранулезы)

1. На предметное стекло наносят небольшую каплю микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают 10-15 минут при комнатной температуре.

2. Накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией.

Гранулы крахмалоподобных веществ (гранулеза) окрашены в синий, а гранулы гликогеноподобных веществ (крахмал) ‑в красновато-коричневый цвет.

Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют либо на предметное стекло вместо воды наносят каплю 0,5%-го раствора HCl и в ней эмульгируют исследуемую культуру.

б). Обнаружение жироподобных веществ

Жировые включения или липидные гранулы в клетках микроорганизмов могут быть представлены нейтральными жирами и поли-β-оксимасляной кислотой. Коэффициент преломления жиров и гранул, состоящих из нейтральных жиров, отличается от коэффициента преломления протоплазмы, поэтому в препарате "раздавленная капля" жир виден в клетках в виде блестящих ярких капелек. Препарат необходимо рассматривать в затемненном поле зрения, опустив конденсор и закрыв диафрагму (объектив х40). Гранулы поли-β-оксимасляной кислоты выявляют с помощью жирорастворимого красителя судана III.

1. Наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло. Добавляют каплю формалина (40%-го), либо 5%-го раствора HCl и выдерживают 5 минут (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку).

2. Добавляют каплю метиленового синего (1:10 либо 1:40) и выдерживают 10 минут.

3. Добавляют каплю концентрированного раствора судана (III) в 90% этаноле и выдерживают 5 минут. Накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с сухой или иммерсионной системой.

Клетки окрашены в синий, включения жира - в розово-оранжевый цвет.

в). Выявление волютина

Волютин-полиметафосфат, в клетках чаще содержится в виде зерен диаметром 0,3 мкм, иногда в дисперсном состоянии. Волютин встречается в клетках многих бактерий и большинства дрожжей. Волютин дает явление метахромазии; на этом основана его окраска метиленовым синим. Волютин растворяется в слабых кислотах и щелочах, но после окраски становится кислотоустойчивым, на этом основан метод Омелянского.

Окраска метиленовым синим: фиксированный мазок дрожжей окрашивают метиленовым синим 3-5 мин, промывают, сушат и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина выглядят красно-фиолетовыми на фоне голубой протоплазмы.

Метод Омелянского: фиксированный мазок окрашивают в течение 30 с фуксином Циля, затем обесцвечивают 1% раствором серной кислоты 30 мин. и после промывания водой докрашивают метиленовым синим 1 мин.; промывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина ‑ ярко-красные, протоплазма ‑ голубая. Препараты зарисовать в цвете.

РАЗДЕЛ 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ

Измерить непочкующиеся клетки по длине и в поперечнике, пользуясь окуляр- и обьект-микрометром (см. методику исследования на с.)

В протоколе исследования по данной работе привести классификацию дрожжей, зарисовать микроскопическую картину изучения морфологии дрожжей, включений в дрожжевую клетку, привести размеры дрожжевой клетки. Сделать вывод по работе.

Поиск по сайту: