 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Хромосомная инверсия
Инверсия. a — нормальная хромосома, b — парацентрическая инверсия, c — перицентрическая инверсия.
Различают парацентрические (инвертированный фрагмент лежит по одну сторону от центромеры) и перицентрические (инвертированный фрагмент лежит по разные стороны от центромеры) инверсии. При инверсиях не происходит потери генетического материала, поэтому инверсии как правило не влияют на фенотип.
Транслокации
Реципрокная транслокация 4 и 20 хромосом человека.
Помимо переносов участков с одной негомологичной хромосомы на другую, классифицируют также реципрокные транслокации (когда две негомологичные хромосомы обмениваются участками), Робертсоновские транслокации (при этом две негомологичные хромосомы объединяются в одну), а также транспозиции (перенос участка хромосомы на другое место на той же хромосоме).
Транслокация, реципрокная транслокация и транспозиция, которые не сопровождаются утратой генетического материала (сбалансированные транслокации), часто не проявляются фенотипически.
На генном уровне изменения первичной структуры ДНК генов под действием мутаций менее значительны, чем при хромосомных мутациях, однако генные мутации встречаются более часто. В результате генных мутаций происходят замены, делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, транслокации, дупликации и инверсии различных частей гена. В том случае, когда под действием мутации изменяется лишь один нуклеотид, говорят о точковых мутациях. Поскольку в состав ДНК входят азотистые основания только двух типов — пурины и пиримидины, все точковые мутации с заменой оснований разделяют на два класса:
1. транзиции (замена пурина на пурин или пиримидина на пиримидин) и
2. трансверсии (замена пурина на пиримидин или наоборот).
Возможны четыре генетических последствия точковых мутаций:
1) сохранение смысла кодона из-за выроженности генетического кода (синонимическая замена нуклеотида),
2) изменение смысла кодона, приводящее к замене аминокислоты в соответствующем месте полипептидной цепи (миссенс-мутация),
3) образование бессмысленного кодона с преждевременной терминацией (нонсенс-мутация). В генетическом коде имеются три бессмысленных кодона: амбер — UAG, охр — UAA и опал — UGA (в соответствии с этим получают название и мутации, приводящие к образованию бессмысленных триплетов — например амбер-мутация),
4) обратная замена (стоп-кодона на смысловой кодон).
По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории:
1) мутации типа замен пар оснований
2) типа сдвига рамки считывания (frameshift). Последние представляют собой делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трем, что связано с триплетностью генетического кода.
Первичную мутацию иногда называют прямой мутацией, а мутацию, восстанавливающую исходную структуру гена, — обратной мутацией, или реверсией. Возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие восстановления функции мутантного гена нередко происходит не за счет истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена или даже другого гена. В этом случае возвратную мутацию называют супрессорной. Генетические механизмы, благодаря которым происходит супрессия мутантного фенотипа, весьма разнообразны.
При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, но и генотип. Восстановление одного фенотипа может произойти и в результате супрессии, т.е. подавления мутантного фенотипа, которое выражается в исправлении мутационного изменения. Так, например, если при первой мутации произошла вставка или выпадение пары нуклеотидов в одном из участков ДНК одного и того же гена, а в другом мутация противоположного рода (выпадение или вставка), то правильность считывания информации восстанавливается. Такая супрессия называется внутригенной.
При внегенной супрессии вторичные мутации, подавляющие выражение первичного мутационного изменения, локализованы в так называемых генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортных РНК (тРНК). Мутации в таком виде могут привести к изменению тРНК, в результате чего в синтезируемый полипептид доставляется нужная аминокислота. При этом происходит восстановление фенотипа, но не генотипа.
По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на:
1) нейтральные, фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков, поскольку они заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента.
2) Условно-летальные, которые приводят к изменению, но не к утрате функциональной активности фермента. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот утрачивать ее. Так, например, ts-мутанты (температурочувствительные) бактерии сохраняют способность к синтезу ферментов функционирующих при 370, но утрачивают этот признак при 420. В то же время у бактерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурах.
3) Летальные мутации характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент или ферменты. Чаще всего эти мутации возникают при обширных делециях, захватывающих группу генов, или при других видах хромосомных мутаций. К ним относятся также мутации в генах, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз.
Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимическихпризнаков, например жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.
23 В чём состоят основные принципы генной инженерии?
Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием несуществующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов.Метод генетической инженерии относится к числу перспективнейших при получении многих белковых биологических веществ, представляющих ценность для медицины. Этим методом получены: интерфероны, интерлейкины, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадки почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и другие.
Достижения генной инженерии позволяют создать новые генетические элементы из нуклеотидных последовательностей, несущие заданную информацию, способы их переноса в клетки про- и эукариотов. Новые генетические элементы представляют собой рекомбинантные молекулы ДНК, которые включают два компонента: вектор-переносчик и клонированную «чужеродную» ДНК. Вектор должен обладать свойствами репликации, обеспечить репликацию вновь созданной рекомбинантной молекулы. Поэтому в качестве вектора используют такие репликоны, как плазмиды, умеренные фаги, вирусы животных, имеющие циркулярную замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК - это фрагмент ДНК, несущий необходимый ген, контролирующий синтез нужного продукта. В настоящее время разработаны различные технологические приемы создания рекомбинантных молекул. Наиболее простой принцип сводится к обработке выделенных молекул ДНК вектора и ДНК, несущей нужный ген, ферментами рестриктазами (эндонуклеазы рестрикции), атакующими взятые молекулы ДНК в строго определеном участке. Некоторые рестриктазы расщепляют молекулы ДНК с образованием однонитевых комплементарных друг другу концов, так называемых «липких» концов.
Таким образом, первым этапом является «разрезание» молекул ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции.
Второй этап состоит в обработке полученных линейных молекул ферментом полинуклеотидлигазой, которая «сшивает» две разные молекулы в одну рекомбинантную,
третий - во введении рекомбинантных молекул методом трансформации в клетки Е. coli или других микроорганизмов, например дрожжей.
24 Структура и типы бактериофагов.
Бактериофа́ги — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНКили, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм. Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток.
Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста В головке содержится генетический материал — одноцепочечная или двуцепочечная РНКили ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруженная белковойили липопротеиновой оболочкой — капсидом, сохраняющим геном вне клетки[9]. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Фаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Хотя они переносят всю информацию для запуска собственной репродукции в соответствующем хозяине, у них отсутствуют механизмы для выработки энергии и рибосомы для синтеза белка. У некоторых фагов в геноме содержится несколько тысяч оснований, тогда как фаг G, самый крупный из секвенированных фагов, содержит 480 000 пар оснований — вдвое больше среднего значения для бактерий, хотя всё же недостаточного количества генов для важнейшего бактериального органоида как рибосомы.
В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклео-капсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов.
Морфология бактериофагов. Типы бактериофаговСтроение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (рис. 5-10). Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов.
• К типу I бактериофагов относят ДНК-содержащие нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды.
• Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.
Бактериофаги типа III имеют короткий хвост (например, Т-фаги 3 и 7).
• Ба • К типу IV относят фаги с несокращаюшимся хвостом и двухнитевой ДНК (например, Т-фаги 1 и 5).
• Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базаль-ной пластиной (например, Т-фаги 2 или 4).
3 и 7).
25 Опишите стадии взаймодействия фага с бактериальной клиткой.
По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги[11]. Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла[8]. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки[7][14].
Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс — созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц[15].
Продолжительность этого процесса может составлять от нескольких минут до нескольких часов[8]. Затем происходит лизис клетки, и освобождаются новые зрелые бактериофаги[11]. Иногда фаг инициирует лизирующий цикл, что приводит к лизису клетки и освобождению новых фагов. В качестве альтернативы фаг может инициировать лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с генетической системой клетки-хозяина, интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды[8]. Таким образом, вирусный геном реплицируется синхронно с ДНК хозяина и делением клетки, а подобное состояние фага называется профагом. Бактерия, содержащая профаг, становится лизогенной до тех пор, пока при определенных условиях или спонтанно профаг не будет стимулирован на осуществление лизирующего цикла репликации. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией или индукцией профага. На индукцию фага оказывает сильное воздействие состояние клетки хозяина предшествующее индукции, также как наличие питательных веществ и другие условия, имеющие место в момент индукции. Скудные условия для роста способствуют лизогенному пути, тогда как хорошие условия способствуют лизирующей реакции[8][11][15].
Очень важным свойством бактериофагов является их специфичность: бактериофаги лизируют культуры определенного вида, более того, существуют так называемые типовые бактериофаги, лизирующие варианты внутри вида, хотя встречаются поливалентные бактериофаги, которые паразитируют в бактериях разных видов[16][17].
26 В чём состоят различия между плазмидами, транспозонами и Is-элементами?
IS-(инсерционные) последовательности (англ. insertion-вставка) – это короткие фрагменты ДНК, мигрирующие от одной хромосомы к другой, или между хромосомой и плазмидой. IS-элементы имеют обычно размеры, не превышающие 2 тысяч пар оснований, или 2 кб(килобаза-тысяча пар оснований). IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают цифрами: IS1, IS2, IS3 и т.д. Содержат только гены, необходимые для собственной миграции. Фенотипических признаков не кодируют, самостоятельно не реплицируются.
Функции IS-элементов:
4. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной клетки и обеспечивать их рекомбинацию.
5. Вызывать инактивацию гена, в котором произошла интеграция IS-последовательности («выключение гена»), либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий – реципиентов), который включает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию.
6. Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликации в 5-9 парах нуклеотидов при включении в бактериальную хромосому.
Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Так же как IS-последовательности являются мигрирующими генетическими элементами. Представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие от 2000 до 20500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации, а при перемещении – делеции и инверсии. Они реплицируются только в составе бактериальной хромосомы. При этом новые копии транспозонов могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Т.о. важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген, кодирующий тот или иной признак.
Кроме того некоторые транспозоны, так же как плазмиды, выполняют регуляторную и кодирующую функцию. В частности, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики. Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. При интеграции транспозонов в хромосому клетки животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами, находящимися в составе их хромосом. Транспозоны, как и IS-последовательности обозначают порядковым номером:Tn1, Tn2, Tn3 и т.д. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации.
Эписомы (умеренные лизогенные и дефектные фаги). Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают лизогению бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Собственно эписомы – это вирусы, обладающие, подобно другим транспонируемым элементам, способностью в интактной форме переходить из одного генома в другой. Изменчивость лизогенных бактерий связана либо с приобретением генов, переносимых данными фагами от их предыдущих хозяев (бактерий-доноров), либо с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. В последнем случае фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий, ряда клостридий и др.
Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликации плазмиды могут давать явление амплификации: одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака.
Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плазмиды называются трансмиссивными или конъюгативными, которыеимеют более крупные размеры и наряду с генетической областью, контролирующей их репликацию, содержат также так называемую tra-область или tra-оперон(англ. transfer перенос). который определяет способность клетки, содержащей плазмиду, быть генетическим донором, т.е. вступать в конъюгацию с другой клеткой (реципиентом) и передавать ей свой генетический материал (плазмидную либо хромосомную ДНК). Под контролем tra-генов синтезируются поверхностные «половые» ворсинки (F-пили) клетки-донора, необходимые для ее конъюгации с клеткой-реципиентом, а также ферменты, обеспечивающие метаболизм ДНК в процессе конъюгации. Неконъюгативные плазмиды. обычно не содержат tra-оперона и поэтому не могут самостоятельно передаваться из одной клетки в другую. Однако передача неконъюгативной плазмиды возможна за счет продуктов (белков) tra-генов конъюгативной плазмиды, находящейся вместе с неконъюгативной плазмидой в одной и той же клетке. Конъюгативные плазмиды переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются F - или R -плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 млн Д) и часто выявляются у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копий на клетку и их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы.
Неконъюгативные плазмиды обычно имеют небольшие размеры и характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae). Мелкие плазмиды могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве во время клеточного деления. При наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид донор может передавать и неконъюгативные плазмиды за счет связывания генетического материала последних с факторами, обеспечивающими их перенос в процессе конъюгации.
Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как IS-последовательностей и транспозонов – в любой ее участок.
В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:
1) R-плазмиды. Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарственным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и условно-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний.
R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входят: r-ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы – IS-последовательности, транспозоны и tra-опероны. R-ген, ответственнен за устойчивость бактерий к какому-либо антибиотику или модификацию. Значительное число r-генов является транспозонами, которые могут перемещаться от плазмиды- носителя в другие репликоны. В одном r-гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным антибиотикам. Этим объясняется множественная лекарственная резистентность.
Tra-оперон, обеспечивающий конъюгативность плазмиды, входит в состав –плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, которые могут передаваться от одной бактерии к другой путем трансдукции.
2) F-плазмиды. Представляет собой циркулярно замкнутую нить ДНК. Она контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Данная плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов. Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F-плазмиды (англ. transfer перенос), обеспечивающим ее конъюгативность. F-плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав последнюю некоторыми веществами, например акриловым оранжевым, в результате чего клетки теряют свойства донора. Сравнительно легкая элиминация и очень быстрая и эффективная передача F-плазмиды реципиентным клеткам дали основание считать, что она располагается в цитоплазме бактерий вне хромосомы. Однако F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии
3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;
Бактериоцины обнаружены у кишечных бактерий (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины).
Колицины энтеробактерий (продуцируемые под контролем колициногенных плазмид) представляют собой вещества белковой природы. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физико-химическим свойствам и по способности адсорбироваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Они обозначаются латинскими буквами A, B, C, D, E1, E2, K и т.д. При обычных условиях культивирования в большинстве клеток бактериальной популяции, содержащей колициногенные особи, синтеза колицина не происходит. Примерно в одной из 1000 клеток отмечается так называемая спонтанная продукция колицина. Однако количество колицинпродуцирующих клеток может быть резко увеличено при обработке бактерий УФ-лучами и некоторыми другими агентами. Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. Показано, что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (Е3) нарушает функцию рибосом, другой (Е) является ферментом – эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий. Колициногенные (Col) плазмиды находятся в клетках энтеробактерий в автономном состоянии и передаются при конъюгацииибез сцепления с хромосомой. Однако некоторые из них (ColV, ColB) могут встраиваться в бактериальную хромосому и находиться в ней в интегрированном состоянии. Они так же как F-плазмиды, передаются путем конъюгации в реципиентные клетки, благодаря имеющемуся у них tra-оперону.
Широкое распространение бактериоциногении среди микрофлоры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влиляющих на формирование микробных биоценозов. Вместе с тем колицины, продуцируемые кишечной палочкой – нормальным обитателем кишечника, могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, попавшие в кишечник, способствуя нормализации его естественного микробиоценоза.
Способность продуцировать различные типы колицинов используется для эпидемиологического маркирования. Такое типирование осуществляется путем определения типа Col-плазмиды (колициногенотипирование) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями (колицинотипирование).
4 ) Плазмиды патогенности:
- Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;
- Hly-плазмиды. Кодирует синтез гемолизинов
5) Плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты деградации (утилизации) природных (мочевина, углеводы) и неприродных (толуол, камфора, нафталин) соединений, необходимых для использования в качестве источников углерода или энергии, что обеспечивает им селективные преимущества перед другими бактериями данного вида. Патогенным бактериям подобные плазмиды придают преимущества перед представителями аутомикрофлоры.
Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины. Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряда сахаров (лактоза, сахароза, раффиноза и др.) и образовании протеолитических ферментов.
Криптические (скрытые) плазмиды не содержат генов, которые можно было бы обнаружить по их фенотипическому проявлению.
Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.
28 Что такое трасформация?
Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцеплений генов. Существуют специальные rec-гены, детермирующие рекомбинационную способность бактерий.
Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем:
· трансформации,
· трансдукции и
· конъюгации,
Рекомбинации – это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом.
Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансформации необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента – компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку. С донорной ДНК в реципиентную клетку обычно передается только один ген. Это связано с протяженностью трансформирующего фрагмента ДНК, который может проникнуть в реципиентную клетку. Обычно он не превышает 1/100 длины бактериальной хромосомы, т.е. включает один или несколько сцепленных генов. Эффективно трансформация происходит в опытах с бактериями одного и того же вида, имеющих разный генотип.
Так, например, в опытах трансформации можно заместить гены «дикого» на мутировавшие или произвести замену обратного порядка. Трансформирующему воздействию ДНК поддаются не все, а только часть клеток бактериальной популяции. Клетки, способные воспринимать донорскую ДНК, называются компетентными. Состояние компетентности непродолжительно. Оно возникает в определенный период роста бактериальной культуры, чаще всего совпадающий с концом логарифмической фазы. В состоянии компетентности клеточная стенка бактерий становится проницаемой для высокополимерных фрагментов ДНК. По-видимому, это связано с тем, что трансформируемый фрагмент ДНК связывается с белком, образуя трансформасому, в которой он переносится в бактериальную клетку. Вместе с тем в трансформосоме он защищен от клеточных нуклеаз.
Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:
1) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;
2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;
3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.
После проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализуется. Затем происходит физическое включение любой из двух нитей ДНК донора в геном реципиента.
Эффективность спаривания трансформирующей ДНК с соответствующим участком хромосомы реципиента зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, что определяет конечный результат трансформации, т.е. количество формирующихся рекомбинантов (трансформантов). Отсюда ясно, почему межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая
29 Что такое трансдукция?
Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один ген или более.
Этот вид генетического обмена открыт Н. Циндером и Дж. Ледербергом в 1951 г. Различают три типа трансдукции:
1) неспецифическую, или общую,
2) специфическую
3) абортивную.
Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. При этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Такие дефектные трансдуцирующие фаги составляют примерно 0,3% всего потомства. При неспецифической трансдукции в клетки реципиентного штамма вместе с фаговой ДНК могут быть перенесены любые гены донора, например гены, контролирующие способность синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, гены резистентности к антибиотикам или др.
Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Таким образом, при неспецифической трансдукции трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, поскольку сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов (трансдуктантов).
Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. Например, трансдуцирующий фаг лямбда (λ) переносит ген gal, контролирующий ферментацию галактозы, или ген bio, ответственный за синтез биотина.
При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.
30Что такое конъюгация?
Конъюгация – обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту.
Процесс конъюгации у бактерий был впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Позднее было показано, что донорами генетического материала являлись клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, не способны быть генетическими донорами. Они являются реципиентами генетического материала и обозначаются как F(-)клетки. При скрещивании F(+) с F(-)клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой, близкой к 100%. При этом почти все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся F(+)клетками. Хромосомная ДНК реплицируется, одна цепь копии хромосомы переносится в реципиентную F(-) клетку, тогда как другая остается в клетке-доноре, т.е. донор сохраняет свое генетическое постоянство.
Важнейшим свойством F-плазмиды является способность включаться (интегрировать) в определенные участки бактериальной хромосомы и становиться ее частью, так же как это имело место в случае умеренного фага λ. В некоторых случаях F-плазмида, аналогично профагу λ, освобождается из хромосомы, захватывая при этом сцепленные с ней бактериальные гены. Такие F-плазмиды обозначают с указанием названия включенного в ее состав гена. Например Flac, которая при передаче реципиенту наделяет его способностью ферментировать лактозу.
Этапы конъюгации:
1) Первым этапом конъюгации является прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili).
2) Затем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии.
Для переноса бактериальной хромосомы необходим разрыв одной из цепей ДНК, который происходит в месте включения F-плазмиды при участии эндонуклеазы.
3) Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры. Оставшаяся в клетке донора нить ДНК является матрицей для синтеза второй нити. Следовательно, при конъюгации передается только одна нить ДНК-донора, а вторая, оставшаяся комплементарная, цепь достраивается в реципиентной клетке.
31 Что такое репарации?
Репарация — клеточный механизм коррекции повреждённой последовательности ДНК (точечные мутации, делеции, структурные нарушения и др.). Клеточный геном (ДНК) не является пассивной мишенью, подвергаемой действию мутагенных факторов. В исследованиях с бактериями было установлено, что они обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала. Эти системы получили название репарационных, а сам процесс восстановления клеточного генома (ДНК) - репараций.
Одна из систем, восстанавливающая повреждения ДНК, вызванные УФ-лучами, названа системой фотореактивации. Ферменты, обеспечивающие фотореактивацию, действуют в присутствии видимого света и осуществляют расщепление тиминовых димеров, превращая их в мономерные формы. Активность другой системы, выполняющей эти же функции, обеспечивается ферментами действующими в отсутствии видимого света. Она названа системой темновой репарации, которую условно подразделяют на дорепликативную и пострепликативную.
Состоит из 5 этапов, контролируемых множеством генов, кодирующих участвующие в репарации ферменты (эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза):
1) распознавание дефекта,
2) рассечение повреждённого участка,
3) удаление «ошибочного» олигонуклеотида,
4) синтез ДНК с использованием комплементарной цепи как матрицы,
5) лигирование.
Репликационная вилка цепи ДНК похожа на застежку разъединенной «молнии». Молекулы ДНК-полимеразы, присоединенные к двум родительским цепям ДНК, работают в противоположных направлениях, синтезируя на каждой из них дочерние нити. На одной цепи ДНК фермент сдвигается к репликационной вилке, на другой новые молекулы полимеразы должны связываться вблизи вилки, чтобы синтезировать вторую нить ДНК между точкой раздвоения и участком связывания предыдущей молекулы фермента.
Отбор нуклеотидов осуществляется ДНК-полимеразой, ведущей синтез ДНК в 2 стадии: 1 - расщепление нуклеотидтрифосфата до монофосфата; 2 - присоединение монофосфата к растущей нуклеотидной цепи. Если полимераза связала некомплементарный нуклеотид, он может быть отвергнут до образования ковалентных связей. Этот процесс называют «редакторской правкой».
«Редакторская правка» осуществляется ферментом экзонуклеазой, ассоциированной с ДНК-полимеразой. Экзонуклеаза удаляет нуклеотиды, только что ошибочно присоединенные к синтезируемой ДНК. При образовании некомплементарной ошибочной пары замедляется включение следующего нуклеотида, и у экзонуклеазы появляется время для исправления ошибки, после чего полимераза делает новую попытку присоединить к цепи ДНК комплементарный нуклеотид.
Процесс дореплиттивной репарации схематически представляя следующим образом:
обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК I эндонуклеазой;
удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой I;
синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити либо ДНК-полимеразой I, либо ДНК-полимеразой III;
«сшивание» восстановительного фрагмента ДНК с основной нитью, осуществляемое лигазой.
Мутанты, утратившие способность к темновой репарации, обладает резко повышенной чувствительностью не только к летальному, но и к мутагенному действию УФ-лучей. Они репарируются системой пострепликативной репарации путем рекомбинаций. При этом дефекты ДНК застраиваются фрагментами неповрежденных нуклеотидов. Повреждения ДНК, вызванные химическими мутагенами, также парируются ферментами бактериальной клетки. SOS-репарация является индуцибельным процессом, который Происходит при множественных изменениях в ДНК. В данном процессе участвует около 20 новых белков. SOS-репарация имеет несколько систем активации. Низкая и средняя системы активации происходит быстро. Однако в этих случаях происходят ошибки. При высокой степени активации наблюдается разрушение хромосомы, амплификация плазмид и переход интегративной фаговой инфекции в продуктивную. В этом случае происходит гибель клетки, но осуществляется спасение маркеров для бактериальной популяции в целом.
Репарирующие системы присущи клеткам млекопитающих и человека. Они способны восстанавливать повреждения клеточного генома, вызванного радиацией. Дефекты этих систем являются причиной ряда заболеваний человека. Так, например, наследственное заболевание человека с летальным исходом Xeroderma pigmentosum связано с отсутствием системы, восстанавливающей повреждение ДНК, вызванное УФ-лучами. В результате этого при УФ-облучении у таких людей возникает рак кожи.
32 Какими признаками характеризуются S- и R-формы бактерий.
R-S-диссоциации
Своеобразной формой изменчивости является R-S-диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (англ. rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип - S-колоний (англ. smooth- гладкий)- имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т.е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые растут в R-форме.
В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.
Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехромосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисахаридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются R-мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций.
Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке.
Вместе с тем S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli О124 и др.
Содержание понятий «эубиоз» и «дисбиоз».
Состояние эубиоза - динамического равновесия микрофлоры и организма человека может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды: состава и качества пищи, курения и употребления алкоголя, нормальной перистальтики и своевременного опорожнения кишечника и мочевого пузыря, качества пережевывания пищи и даже характера трудовой деятельности (сидячий или иной), стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой и химиотерапии. В результате нарушается колонизационная резистентность. Аномально размножившиеся микроорганизмы продуцируют токсичные продукты метаболизма - индол, скатол, аммиак, сероводород. Такое состояние, развивающееся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называется дисбактериозом или дисбиозом (дисбиоценоз). При дисбактериозе происходят изменения количественного соотношения и состава нормальной микрофлоры организма, главным образом его кишечника, при котором происходит уменьшение количества или исчезновение обычно составляющих ее микроорганизмов и появление в большом количестве редко встречающихся или несвойственных ей микробов, а также изменение сферы их обитания. Наиболее тяжелые формы дисбактериозов - стафилококковый сепсис, системный кандидоз и псевдомембранозный колит; среди всех форм доминируют поражения микрофлоры кишечника.
Для лечения дисбактериоза используют длительное время препараты, содержащие представителей нормальной микрофлоры, например, бифидобактерии (бифидумбактерин), лактобактерии (лактобактерин), бифидобактерии и кишечную палочку (бификол) и др. Кроме того необходимо соблюдать определенную диету с преобладанием в рационе молочно-растительной пищи, а также психотерапию с настроем на добрые чувства.
34 Основные физиологические функции естественной микрофлоры человека на примере кишечного тракта. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ)
Наиболее активно бактерии заселяют ЖКТ; при этом колонизация осуществляется «по этажам».
В желудке здорового человека микробов практически нет, что вызвано действием желудочного сока. Тем не менее отдельные виды (например, Helicobacter pylori) адаптировались к обитанию на слизистой оболочке желудка.
Верхние отделы тонкой кишки также относительно свободны от бактерий, что связано с неблагоприятным действием щелочного рН и пищеварительных ферментов. Тем не менее, в этих отделах можно обнаружить кандиды, стрептококки и лактобациллы.
Нижние отделы тонкой и, особенно, толстой кишки - огромный резервуар бактерий; их содержание может достигать 1012 в 1 г фекалий (30% сухой массы кала).
Микрофлора кишечника представлена тремя основными группами.
К 1-й группе относятся грамположительные бесспоровые анаэробы - бифидобактерии и грамотрицательные бактероиды, составляющие 95% микробиоценоза.
2-я группа (сопутствующая микрофлора) представлена в основном аэробами (лактобактерии, кокковая флора, Еscherichia coli) удельный вес ее невелик и не превышает 5%. Лактобактерии и нормальная E. coli являются синергистами бифидобактерий.
В 3-ю группу включают редко встречающуюся микрофлору условно-патогенную или факультативную). Ее удельный вес не превышает 0,01-0,001% от общего количества микробов. Представителями факультативной микрофлоры являются протей, синегнойная палочка, стафилококк, кандида, серрацина, цитро-, энтеро- и кампилобактерии.
Представители 2-й и 3-й групп в физиологических условиях являются симбионтами 1-й группы, прекрасно с ней сосуществуют, не нанося вреда, проявляя агрессивные свойства лишь при определенных условиях.
1. 35 Какие физические и химические факторы наиболее сильно подавляют микроорганизмы?
Поиск по сайту: