Методы микроскопии в МБ

Для МБ-их исследований используют нес-ко типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный).

Биологический микроскоп предназначен для изучения формы, структуры, размеров и других признаков различных м/о, величина которых не менее 0,2-0,3 мкм.

Окрашенный препарат микроскопируется с помощью масляной иммерсионной системы. Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой объектива и препаратом помещается иммерсионная жидкость, имеющая показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости используют кедровое масло.

Техника микроскопирования:

- включают лампу осветителя.

- пипеткой помещают каплю кедрового масла на препарат.

- размещают препарат на предметный столик микроскопа.

- поворачивают револьвер до отметки иммерсионного объектива 90

- наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до погружения объектива в каплю масла

- глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения (ориентировочный фокус) и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу позволяют максимально использовать все его возможности, облегчить условия работы и значительно расширить диапазон применения. В МБ-их лабораториях обычно используют темнопольные кардиоид- и параболоид-конденсоры; фазово-контрастное приспособление; бинокулярную насадку, приближающую микроскопию к условиям естественного зрения; осветители, обеспечивающие оптимальное и стабильное освещение; окуляр-микрометр и объект-микрометр для измерения микроскопических объектов; нагревательный столик, устанавливаемый вместо предметного столика для обеспечения постоянной t 37^оС при длительном наблюдении за живыми м/о; рисовальный аппарат для зарисовки препарата, с помощью которого можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта; цветные, нейтральные и тепловые оптические светофильтры, устанавливаемые между источником света и микроскопом и применяемые при микрофотографии и специальных методах микроскопии; микроустановка для цейтраферной (прерывистой) микрокиносъемки, которая в сочетании с фазово-контрастной микроскопией используется для изучения динамики развития и размножения м/о.

Темнопольная микроскопия основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается при помощи кардиоид- или параболоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе. Параболоид-конденсор имеет затемнение в центре, задерживающее центральные лучи света, и внутреннюю зеркальную поверхность для отражения лучей. В кардиоид-конденсоре лучи сначала отражаются от выпуклой поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, в связи с чем поле зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объекта лучи, которые образуют весьма характерное изображение ярко светящихся контуров микробных клеток и других частиц, находящихся в препарате на темном фоне.

Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны ч/з так называемые фазовые (прозрчные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих ч/з объект, превращаются в амплитудные, и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая м.б. позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным – светлое изображение объекта на темном фоне.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция (lumen – свет) – свечение веществ, возникающее после возд-вия на них каких-либо источников энергии (света, электронных лучей, ионизирующего излучения). Фотолюминесценция – люминесценция объекта под влиянием света. Свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждающий, поэтому возбуждают люминесценцию коротковолновыми лучами. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, желтого или зеленого цвета. В рез-те возникает цветное изображение объекта. Длина волны излучаемого света (цвет люминесценции) зависит от ф-х структуры люминесцирующего вещ-ва. Первичная (собственная) люм-ия наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) – после окраски препаратов специальными люминесцир. красителями – флюорохромами. Люминесц. микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможность исследования живых м/о и обнаружения их в небольших конц-циях вследствие высокой степени контрастности.

Электронная микроскопия позволяет наблюдать объекты, размеры которых < 0,2 мкм и применяется для изучения вирусов, тонкого строения м/о, макромолекулярных структур и др. Световые лучи в таких микроскопах заменены на поток электронов (длина волны ≈0,005 нм, т.е. почти в 100 тыс. раз короче длины волны видимого света). Общее полезное увеличение – до 1 млн. раз.

NB Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие эл. микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение объекта, но их разрешающая способность значительно ниже

Поиск по сайту: