Методы индикации и идентификации вирусов

Индикация вирусов

Индикацию вирусов, имеющих в суперкапсидной оболочке фермент «гемагг-лютинин», можно проводить с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Под действием вирусного гемагглютинина in vitro происходит склеивание эритроцитов. В результате формируется осадок эритроцитов с неровными, фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика». При отрицательной реакции, в случае отсутст­вия вируса в исследуемом материале, осадок эритроцитов имеет вид «пуговицы» с ровными краями. РГА - неспецифическая, несерологическая реакция. Несерологическая, т.к. в ней не участвует иммунная диагностическая сыворотка. Неспецифическая, т.к. разные вирусы могут агглютинировать эритроциты животных разных видов. В частности, вирус гриппа хорошо агглютинирует куриные и человеческие эритроциты, вирус клещевого энцефалита - гусиные эритроциты.

Индикацию вирусов можно проводить по их цитопатогеныому действию (ЦПД) на культуру клеток. Это действие выражается в повреждении монослоя за­раженной культуры клеток и изменении их морфологии (дегенерация). При этом клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Возможно образование многоядерных клеток (симпласт), в частности, под действием респираторно-синцитиального вируса. В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла - нарушение монослоя.

Методы титрования (количественное определение) вирусов.

Титрование вирусов осуществляют на различных биологических моделях.

Если вирусом заражают лабораторных животных, то единицей измерения силы (дозы) вируса будет LD50.

LD50 — то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт животных определенного веса, определенного вида (иногда пола) в определенный

срок.

Если исследуемым вирусом заражают куриные эмбрионы, то титр (доза) вируса определяется в ED50 (эмбриональная доза).

ЕДзо - то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт куриных эмбрионов.

Если исследуемым вирусом заражают культуру клеток, то титр вируса измеряется в ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза) и БОЕ (бляшкообразующая единица).

ТЦДм — то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт культур клеток.

Более точным является второй метод, определяющий абсолютное количество вирусов в исследуемом материале по количеству бляшек (БОЕ), т.е. участков по гибших клеток культуры ткани под действием инфицирующего агента. Сколько образуется бляшек, столько и вирусных частиц в исследуемом материале.

Идентификация вирусов.

Идентификацию вирусов по антигенным свойствам осуществляют постановкой серологических реакций со специфическими диагностическими противовирусными сыворотками. Основными серологическими реакциями, используемыми для идентификации вирусов, являются: реакция торможения гемахтлютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток и иммуноферментный метод (ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации ГРТГА) — 2-х компонентная, сложная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) 1% взвесь эритроцитов (как индикатор).

Постановка FIT А состоит из следующих этапов: вначале соединяют вируссо-держашую жидкость с разведениями диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины и оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции производят через 1 -2 часа.

Если тип вируса соответствует типу сыворотки, то вирусный гемагглютинин будет блокироваться антителами сыворотки, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов. Такая реакция учитывается как положительная. Визуально в лунках определяется осадок эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

С другими диагностическими противовирусными сыворотками, взятыми для постановки РТГА, реакция будет отрицательной из-за несоответствия типа вируса типу сыворотки. Визуально определяется осадок эритроцитов с неровными фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика» (гемагглютинация).

РТГА применяется для идентификации вирусов гриппа, клещевого энцефалита.

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток - 2-х компонентная, слож­ная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) культура клеток (в качестве индикатора).

Постановка РН состоит из следующих этапов: вначале выделенный цитопато-генный вирус смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сы­воротками. Смеси выдерживают 1 час при комнатной температуре. Затем этими смесями заражают флаконы с культурой клеток. Если тип вируса соответствует ти­пу сыворотки, то произойдет нейтрализация вируса антителами сыворотки и куль­тура клеток будет без изменений (положительная реакция).

30. Вирусы бактерий (бактериофаги). Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги.

Бактериофаги - вирусы бактерий. Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, нередко заканчивающийся разрушением, лизисом бактерий.

Бактериофаги были открыты в 1916 г. канадским ученым Ф.Д.Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрующийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последую­щие наблюдения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных водах, кишечном тракте человека и животных, гнойном отделяемом и других субстратах.

Структура сложноустроенного бактериофага

- головка, в которой содержится нуклеиновая кислота;

- воротничковая часть;

- отросток, представляющий собой полый стержень, сверху покрытый со­кратительным чехлом. На конце отростка находятся 6-ти зубая пластинка для адсорбции фага на бактериальной клетке и нити прикрепления.

Оболочечные структуры фага имеют белковую природу.

У слоожноустроенного бактериофага бинарный (двойной) тип симметрии, т.к. головка имеет кубический тип симметрии, а отросток - спиральный.

Кроме сложноустроенного, существуют и другие морфологические формы бактериофагов, содержащие либо ДНК, либо РНК и объединенные А.С.Тихоненко в 5 основных групп

1. Фаги I типа - нитевидной формы. Имеют спиральный тип симметрии, ДНК-содержащие.

2. Фаги II типа - имеют головку и рудимент отростка. Кубический тип симметрии. Большинство из них - РНК-содержащие.

3. Фаги Ш типа - имеют головку с коротким отростком. Бинарный тип

симметрии. ДНК-содержащие.

4. Фаги IV типа - имеют головку и длинный несокращающийся отросток. Бинарный тип симметрии, ДНК-содержащие.

5. Фаги V типа - имеют головку и длинный сокращающийся отросток. Би­нарный тип симметрии. ДНК-содержащие.

Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагии.

В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, различают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные фаги способны вызывать острую продуктивную инфекцию на уровне клетки. Умеренные фаги чаще вызывают ннтегратианую вирусную инфекцию на уровне клетки, реже - продуктивную.

Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага с клеткой:

L Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы 6-ти зубой пластины и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, мико плазмы), бактериофаги не адсорби­руются.

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку путем впрыскивания, при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки.

3. Эклипсная фаза. Синтез фаговых частиц, подобно синтезу вирусов в эукариотической клетке. Происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образованием множественных копий, а на рибосомах бактериальной клетки - синтез фаговых белков. В результате образуется вегетативный фаг, т.е.

неоформленный фаговый материал (белковые оболочки и нуклеиновые кисло­ты).
4. Композиция фаговых частиц. Происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги.

5. Выход фага из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого бактериофагом, что приводит к гибели бактерий.

Таким образом, сложноустроенный бактериофаг отличается от других вирусов по следующим признакам:

а) наличие бинарного типа симметрии;

б) наличие подвижного сократительного чехла на отростке;

в) внедрение нуклеиновой кислоты бактериофага в клетку путем впрыски­вания (инъекцонный механизм).

Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных на

жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлением среды В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рис.5), которые называются негативными колониями или стериль­ными бляшками.

31. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине. Практическое применение бактериофагов.

1. Для диагностики инфекционных заболеваний. Используют метод фаго-тшшрования, когда с помощью известного набора фагов определяют фаговар исследуемых бактерий. Метод основан на специфичности фагов, т.е. способности взаимодействовать только с бактериями, имеющими специфические к фагу рецепторы, и вызывать их лизис. Используется для диагностики брюшного тифа, дизентерии, чумы, холеры, стафилококковых инфекций.

Метод фаготипирования имеет важное эпидемиологическое значение, т.к. позволяет установить связи между источником инфекции и отдельными случаями заболеваний.

2. Для лечения:

а) стафилококковый бактериофаг — при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных S. aureus;

б) бактериофаг P. aeruginosa - при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных синегнойной палочкой.

Существуют комбинированные многокомпонентные препараты бактериофагов:

- коли-протейный бактериофаг - при колиинфекциях, вызванных диарее-генными эшерихиями и протейных дисбактериозах;

- пиобактериофаг - для лечения стафилококковой, стрептококковой, клеб-сиеллезной, протейной инфекций, а также заболеваний, вызванных диареегенными эшерихиями и синегнойной палочкой;

- интести-бактериофаг - для лечения бактериальной дизентерии, сальмонелл езов, колиинфекций, а также протейной, стафилококковой, энтерококковой и синегнойной инфекций.

Бактериофаги применяют местно путем аппликации на раневую или ожоговую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, мочевой пузырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения препараты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах: жидком виде, таблетках, мазях, свечах, аэрозолях. Перед назначением бакте­риофага необходимо поставить пробу на чувствительность к нему выделенной культуры микроорганизмов.

2. Для профилактики в очагах инфекции: брюшнотифозный бактериофаг, поливалентный дизентерийный бактериофаг.

32. Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы вне-хромосомной наследственности (плазмиды, инсерционные элементы, транспо-зоны).

Генетический материал бактериальной клетки:

1. Имеется одна хромосома, замкнутая в виде кольца, т.е. бактериальная клетка гаплоидна, в отличие от эукариотических клеток с диплоидным набором хромосом. Хромосомная ДНК находится в суперепирализованной форме.

2. В бактериях могут присутствовать внехромосомные молекулы ДНК: плазмиды, инсерционные элементы, транспозоны.

3. Хромосомный и внехромосомный генетический материал располагается в цитоплазме бактерий свободно, без отграничения от нее мембранами.

4. Помимо основного, т.е. наследственного механизма передачи генов, у бактерий есть другие формы передачи генетического материала между отдель­ными особями в популяции клеток: трансформация, трансдукция, фаговая конверсия, конъюгация.

Поиск по сайту: