АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Методы индикации и идентификации вирусов

Читайте также:
  1. I. Иммунология. Определение, задачи, методы. История развитии иммунологии.
  2. I. Методы механического разобщения бактерий.
  3. I. Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК.
  4. II. Методы непрямого остеосинтеза.
  5. II. Рыночные методы.
  6. III. Методы искусственной физико-химической детоксикации.
  7. III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
  8. III. Параметрические методы.
  9. IV. МЕТОДЫ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ТЕОРИИ, ЭКОНОМИЧЕСКИЕ ЗАКОНЫ И КАТЕГОРИИ
  10. IV. Современные методы синтеза неорганических материалов с заданной структурой
  11. V2: История предмета и методы микроэкономики.
  12. VI. Методы, основанные на модификации генетической информации.

Индикация вирусов

Индикацию вирусов, имеющих в суперкапсидной оболочке фермент «гемагг-лютинин», можно проводить с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Под действием вирусного гемагглютинина in vitro происходит склеивание эритроцитов. В результате формируется осадок эритроцитов с неровными, фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика». При отрицательной реакции, в случае отсутст­вия вируса в исследуемом материале, осадок эритроцитов имеет вид «пуговицы» с ровными краями. РГА - неспецифическая, несерологическая реакция. Несерологическая, т.к. в ней не участвует иммунная диагностическая сыворотка. Неспецифическая, т.к. разные вирусы могут агглютинировать эритроциты животных разных видов. В частности, вирус гриппа хорошо агглютинирует куриные и человеческие эритроциты, вирус клещевого энцефалита - гусиные эритроциты.

Индикацию вирусов можно проводить по их цитопатогеныому действию (ЦПД) на культуру клеток. Это действие выражается в повреждении монослоя за­раженной культуры клеток и изменении их морфологии (дегенерация). При этом клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Возможно образование многоядерных клеток (симпласт), в частности, под действием респираторно-синцитиального вируса. В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла - нарушение монослоя.

Методы титрования (количественное определение) вирусов.

Титрование вирусов осуществляют на различных биологических моделях.

Если вирусом заражают лабораторных животных, то единицей измерения силы (дозы) вируса будет LD50.

LD50 то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт животных определенного веса, определенного вида (иногда пола) в определенный

срок.

Если исследуемым вирусом заражают куриные эмбрионы, то титр (доза) вируса определяется в ED50 (эмбриональная доза).

ЕДзо - то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт куриных эмбрионов.

Если исследуемым вирусом заражают культуру клеток, то титр вируса измеряется в ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза) и БОЕ (бляшкообразующая единица).

ТЦДм — то количество вирусов, которое вызывает гибель 50% взятых в опыт культур клеток.

Более точным является второй метод, определяющий абсолютное количество вирусов в исследуемом материале по количеству бляшек (БОЕ), т.е. участков по гибших клеток культуры ткани под действием инфицирующего агента. Сколько образуется бляшек, столько и вирусных частиц в исследуемом материале.

Идентификация вирусов.

Идентификацию вирусов по антигенным свойствам осуществляют постановкой серологических реакций со специфическими диагностическими противовирусными сыворотками. Основными серологическими реакциями, используемыми для идентификации вирусов, являются: реакция торможения гемахтлютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток и иммуноферментный метод (ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации ГРТГА) — 2-х компонентная, сложная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) 1% взвесь эритроцитов (как индикатор).

Постановка FIT А состоит из следующих этапов: вначале соединяют вируссо-держашую жидкость с разведениями диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины и оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции производят через 1 -2 часа.

Если тип вируса соответствует типу сыворотки, то вирусный гемагглютинин будет блокироваться антителами сыворотки, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов. Такая реакция учитывается как положительная. Визуально в лунках определяется осадок эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

С другими диагностическими противовирусными сыворотками, взятыми для постановки РТГА, реакция будет отрицательной из-за несоответствия типа вируса типу сыворотки. Визуально определяется осадок эритроцитов с неровными фестончатыми краями, в виде «перевернутого зонтика» (гемагглютинация).

РТГА применяется для идентификации вирусов гриппа, клещевого энцефалита.

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток - 2-х компонентная, слож­ная серологическая реакция. Компоненты реакции:

а) исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг);

б) типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат);

в) культура клеток (в качестве индикатора).

Постановка РН состоит из следующих этапов: вначале выделенный цитопато-генный вирус смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сы­воротками. Смеси выдерживают 1 час при комнатной температуре. Затем этими смесями заражают флаконы с культурой клеток. Если тип вируса соответствует ти­пу сыворотки, то произойдет нейтрализация вируса антителами сыворотки и куль­тура клеток будет без изменений (положительная реакция).

 

30. Вирусы бактерий (бактериофаги). Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги.

Бактериофаги - вирусы бактерий. Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, нередко заканчивающийся разрушением, лизисом бактерий.

Бактериофаги были открыты в 1916 г. канадским ученым Ф.Д.Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрующийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последую­щие наблюдения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных водах, кишечном тракте человека и животных, гнойном отделяемом и других субстратах.

Структура сложноустроенного бактериофага

- головка, в которой содержится нуклеиновая кислота;

- воротничковая часть;

- отросток, представляющий собой полый стержень, сверху покрытый со­кратительным чехлом. На конце отростка находятся 6-ти зубая пластинка для адсорбции фага на бактериальной клетке и нити прикрепления.

Оболочечные структуры фага имеют белковую природу.

У слоожноустроенного бактериофага бинарный (двойной) тип симметрии, т.к. головка имеет кубический тип симметрии, а отросток - спиральный.

Кроме сложноустроенного, существуют и другие морфологические формы бактериофагов, содержащие либо ДНК, либо РНК и объединенные А.С.Тихоненко в 5 основных групп

1. Фаги I типа - нитевидной формы. Имеют спиральный тип симметрии, ДНК-содержащие.

2. Фаги II типа - имеют головку и рудимент отростка. Кубический тип симметрии. Большинство из них - РНК-содержащие.

3. Фаги Ш типа - имеют головку с коротким отростком. Бинарный тип

симметрии. ДНК-содержащие.

4. Фаги IV типа - имеют головку и длинный несокращающийся отросток. Бинарный тип симметрии, ДНК-содержащие.

5. Фаги V типа - имеют головку и длинный сокращающийся отросток. Би­нарный тип симметрии. ДНК-содержащие.

Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагии.

В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, различают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные фаги способны вызывать острую продуктивную инфекцию на уровне клетки. Умеренные фаги чаще вызывают ннтегратианую вирусную инфекцию на уровне клетки, реже - продуктивную.

Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага с клеткой:

L Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы 6-ти зубой пластины и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, мико плазмы), бактериофаги не адсорби­руются.

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку путем впрыскивания, при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки.

3. Эклипсная фаза. Синтез фаговых частиц, подобно синтезу вирусов в эукариотической клетке. Происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образованием множественных копий, а на рибосомах бактериальной клетки - синтез фаговых белков. В результате образуется вегетативный фаг, т.е.

неоформленный фаговый материал (белковые оболочки и нуклеиновые кисло­ты).
4. Композиция фаговых частиц. Происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги.

5. Выход фага из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого бактериофагом, что приводит к гибели бактерий.

Таким образом, сложноустроенный бактериофаг отличается от других вирусов по следующим признакам:

а) наличие бинарного типа симметрии;

б) наличие подвижного сократительного чехла на отростке;

в) внедрение нуклеиновой кислоты бактериофага в клетку путем впрыски­вания (инъекцонный механизм).

Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных на

жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлением среды В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рис.5), которые называются негативными колониями или стериль­ными бляшками.

 

31. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине. Практическое применение бактериофагов.

1. Для диагностики инфекционных заболеваний. Используют метод фаго-тшшрования, когда с помощью известного набора фагов определяют фаговар исследуемых бактерий. Метод основан на специфичности фагов, т.е. способности взаимодействовать только с бактериями, имеющими специфические к фагу рецепторы, и вызывать их лизис. Используется для диагностики брюшного тифа, дизентерии, чумы, холеры, стафилококковых инфекций.

Метод фаготипирования имеет важное эпидемиологическое значение, т.к. позволяет установить связи между источником инфекции и отдельными случаями заболеваний.

2. Для лечения:

а) стафилококковый бактериофаг — при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных S. aureus;

б) бактериофаг P. aeruginosa - при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных синегнойной палочкой.

Существуют комбинированные многокомпонентные препараты бактериофагов:

- коли-протейный бактериофаг - при колиинфекциях, вызванных диарее-генными эшерихиями и протейных дисбактериозах;

- пиобактериофаг - для лечения стафилококковой, стрептококковой, клеб-сиеллезной, протейной инфекций, а также заболеваний, вызванных диареегенными эшерихиями и синегнойной палочкой;

- интести-бактериофаг - для лечения бактериальной дизентерии, сальмонелл езов, колиинфекций, а также протейной, стафилококковой, энтерококковой и синегнойной инфекций.

Бактериофаги применяют местно путем аппликации на раневую или ожоговую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, мочевой пузырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения препараты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах: жидком виде, таблетках, мазях, свечах, аэрозолях. Перед назначением бакте­риофага необходимо поставить пробу на чувствительность к нему выделенной культуры микроорганизмов.

2. Для профилактики в очагах инфекции: брюшнотифозный бактериофаг, поливалентный дизентерийный бактериофаг.

32. Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы вне-хромосомной наследственности (плазмиды, инсерционные элементы, транспо-зоны).

Генетический материал бактериальной клетки:

1. Имеется одна хромосома, замкнутая в виде кольца, т.е. бактериальная клетка гаплоидна, в отличие от эукариотических клеток с диплоидным набором хромосом. Хромосомная ДНК находится в суперепирализованной форме.

2. В бактериях могут присутствовать внехромосомные молекулы ДНК: плазмиды, инсерционные элементы, транспозоны.

3. Хромосомный и внехромосомный генетический материал располагается в цитоплазме бактерий свободно, без отграничения от нее мембранами.

4. Помимо основного, т.е. наследственного механизма передачи генов, у бактерий есть другие формы передачи генетического материала между отдель­ными особями в популяции клеток: трансформация, трансдукция, фаговая конверсия, конъюгация.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.007 сек.)