АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

VI. Методы, основанные на модификации генетической информации

Читайте также:
  1. I . Экономически обоснованные страховые тарифы.
  2. I. Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК.
  3. III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
  4. V. Полный опросник для больных неврозами по э. Берну (в модификации м. Е. Литвака)
  5. Административными методами можно предотвратить необоснованные расходы (хищение, злоупотребление).
  6. Асимметрия информации. Моральный риск.
  7. Блок информации.
  8. Бюджетный федерализм автономное функционирование бюджетов отдельных уровней власти и бюджетные взаимоотношения, основанные на четко сформулированных нормах.
  9. В модификации Дэвени и Гергей
  10. В. Методы, дающие косвенные визуальные данные звучащей речи
  11. Виды информации.

Эта группа методов используется для определения структуры и функций генов. Модификация генетической информации приводит к утрате или приобретению генов, что сопровождается изменением фенотипа. Заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения фенотипических признаков, присущих исходному и генетически модифицированному микроорганизму.

1. Конъюгация.Используют для картирования генома – определения местоположения генов и расстояния между ними. Способность к конъюгации клеток определяется присутствием плазмиды фертильности – F-плазмиды, которая кодирует конъюгативные пили. F плазмида может интегрировать в бактериальную хромосому, и в таком состоянии носит название Hfr. После образования конъюгационной пары, Hfr фактор инициирует перенос копии бактериальной хромосомы донора в реципиентную клетку, при этом в последнюю очередь переносится в составе бактериальной хромосомы Hfr фактор. Так как перенос всей хромосомы продолжается при 370С около 100 мин, то прерывая конъюгацию в разное время, можно определить какие гены и в какой последовательности попадают в клетку реципиента. Впервые метод использован Жакобом и Вольманом в 1964 году для построения генетической карты Е.coli (рис. 39).

Мин

Thr

Trp

Рис. 39.Первая карта участка хромосомы E.coli, построенная Жакобом и Вольманом в 1964 г. на основании определения времени переноса соответствующего гена из донорской клетки в реципиентную

 

Постановка опыта конъюгации. Для постановки классического опыта конъюгации используют взаимно дополняющие друг друга по двум признакам донорский и реципиентный штаммыE. coli (табл. 15).Бульонные культуры донора и реципиента объемом 0,5 мл смешивают, смесь инкубируют 30 мин при 370С. Для выделения рекомбинантных клеток, смесь высевают наминимальную (глюкозосолевую) среду со стрептомицином. В качестве контроля на среду засевают донорский и реципиентный штаммы, которые не способны расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй – не синтезирует лейцин. После подсчёта выросших колоний рекомбинантов определяют частоту рекомбинаций, равную отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.



Таблица 15

Характеристика штаммов E. сoli, участсвующих в процессе конъюгации

Свойства E. coli
донор (F+,leu+, strs) реципиент (F-, leu-, strr) рекомбинант (F+, leu+, strr)
Наличие F-плазмиды да нет да
Синтез лейцина да нет да
Устойчивость к стрептомицину нет да да
Рост на минимальной среде (без лейцина) со стрептомицином нет нет да

2. Трансдукция– горизонтальный перенос генов от донора к реципиенту умеренными бактериофагами.

Для доказательства существования трансдукции может быть приведен опыт по горизонтальному переносу от донора к реципиенту геновβ-галактозидазного оперона, контролирующего расщепление лактозы у Е. coli. Для проведения опыта необходимы:

-реципиент - штамм E. coli, лишенный β-галактозидазного оперона (E. coli lac-), на среде Эндо образует бесцветные колонии;

- трансдуцирующий фаг - фаг (λ dgal), в геноме которого часть генов замещена генами β-галактозидазного оперона E. coli. Концентрация фага - 106-107 частиц в 1 мл;

- селективная среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бесцветны, а лактозоположительные колонии - ярко малиновые, с металлическим оттенком.

Постановка опыта трансдукции. Смешивают по 1 мл трехчасовой бульонной культуры реципиента и трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют 60 мин при +370С, готовят серию десятикратных разведений. Из пробирки с разведением 10-6 по 0,1 мл культуры высевают на среду Эндо и инкубируют в течение суток. Рекомбинантные клетки растут с образованием малиновых с металлическим оттенком колоний. Частота трансдукций равна отношению количества клеток рекомбинантов к числу реципиентов.

3. Трансформация - горизонтальный перенос генов от донора к реципиенту через внешнюю среду; осуществляемый после гибели бактерий-доноров.

Для проведения опыта необходимы следующие материалы:

-реципиент - штамм Bacillus subtilis (strs), чувствительный к стрептомицину;

‡агрузка...

- ДНК донора – выделяют из штамма B. subtilis (strr), устойчивого к стрептомицину;

- селективная среда - МПА со стрептомицином.

Постановка опыта трансформации. Смешивают по 1мл бульонной культуры B. subtilis и ДНК донора. Инкубируют 30 мин при +370С, и высевают на МПА и МПА со стрептомицином. Рекомбинантные штаммы способны расти на селективной среде со стрептомицином. Частота трансформаций равна отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

4. Сайт-специфический мутагенез. Это совокупность молекулярно-генетических методов, которые позволяют создавать мутации в определенном участке ДНК. Для этого метода необходимо знание первичной структуры исследуемой ДНК, т.е. она должна быть секвенирована. Метод впервые описан в 1978 году Микаэлем Смитом, который в 1993 году получил Нобелевскую премию.

Этапы сайт-специфического мутагенеза:

а) создание множественных мутантных копий изучаемого гена при помощи ПЦР. Мутантные копии гена получают путем введения мутантных последовательностей в состав праймера, поэтому образуемые в ПЦР копии гена несут известную мутацию (например, чувствительность к ампициллину).

б) внесение полученных копий мутантного гена в клетку-реципиент с помощью плазмидного вектора с двойной фенотипической меткой (например, генами устойчивости к тетрациклину и ампициллину). Изучаемый клонированный ген вводят в плазмидный вектор в месте нахождения гена устойчивости к ампициллину. Плазмидный вектор используют в качестве средства доставки клонированного гена в реципиентную клетку. Доставка осуществляется путем электропорации (трансформации под действием мощного электрического разряда) реципиентных клеток.

В случае успешно проведенного клонирования реципиентные клетки проявляют чувствительность к ампициллину и приобретают устойчивость к тетрациклину.

в) селекция мутантов с помощью метода реплик и использования сред с ампициллином и тетрациклином.

5. Методы селекции мутантов.Для выделения мутантов используют:

а) посев на минимальные среды, лишенные одного из ростовых компонентов. На этих средах растут микроорганизмы, способные синтезировать недостающий компонент.

б) посев на селективные среды, содержащие ингибирующие добавки, способствующие избирательному росту устойчивых к ним микроорганизмов. В качестве ингибирующих добавок могут выступать антибиотики, соли, анилиновые красители, желчные кислоты. На этих средах растут микроорганизмы, обладающие факторами устойчивости к ингибирующему агенту.

в) посев методом реплик одновременно большого количества изучаемых микроорганизмов (25, 50, 96 культур) при помощи штампа-репликатора. Этапы метода реплик:

- внесение тест-культур в лунки донышка штампа-репликатора;

- инокуляция штифтов штампа репликатора тест-культурами (штифты опускают в лунки);

- посев на среду методом отпечатков;

- культивирование и учет результатов (рис. 40). На простой ростовой среде вырастают все микроорганизмы, в то время как на селективной среде - только мутантные микроорганизмы, устойчивые к ингибирующему агенту.

г) использование биосенсоров – молекул-репортеров, которые сообщают о присутствии микроорганизма, его антигенов, метаболитов и т.д.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |


Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.012 сек.)