АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Определение биохимических свойств микроорганизмов

Читайте также:
  1. A) Определение массы тела по растяжению пружины
  2. Access. Базы данных. Определение ключей и составление запросов.
  3. c) Определение массы тела по зависимости момента инерции системы, совершающей крутильные колебания от квадрата расстояния тела до оси вращения
  4. F. Метод, основанный на использовании свойства монотонности показательной функции .
  5. I. Дифракция Фраунгофера на одной щели и определение ширины щели.
  6. I. Иммунология. Определение, задачи, методы. История развитии иммунологии.
  7. I. Определение
  8. I. Определение
  9. I. Определение основной и дополнительной зарплаты работников ведется с учетом рабочих, предусмотренных технологической картой.
  10. I. Определение пероксида водорода (перекиси водорода)
  11. I. Определение проблемы и целей исследования
  12. I. Определение ранга матрицы
Фермент Среда для детекции Положительная реакция
САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Амилаза Крахмальный агар (агар с 0,2% крахмала) и раствор Люголя.   При нанесении раствора йода на среду с 18 - 24 часовой культурой микроорганизмов, вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как остальная среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала.
Карбо-гидразы Дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители. Лактозопозитивные энтеробактерии (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumonia), образуют ярко окрашенные колонии, лактозонегнативные энтеробактерии (Salmonella, Shigella) – бледно-розовые или бесцветные колоний.
Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницкого и др.). Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2+, феноловый красный (индикатор рН). При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика; при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола.
Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса; содержат один из углеводов, индикатор рН (табл. 5); рН среды устанавливают 7,2±0,2. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок. При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде.
Продукция ацетил-метил-карбинола Выявляют с помощью реакции Фогес-Проскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН. После добавления к культуре равного объёма 10% или 20% КОН и инкубации 4-24 часа при 370С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с жёлтым оттенком; в случае образования ацетоина и 2,3-бутиленгликоля окраска не изменяется.
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Протеазы и пептидазы 5% обезжиренное молоко. Происходит свёртывание с образованием сгустков казеина и пептонизация с лизис казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно.
Свёрнутая сыворотка. Происходит разжижение.
Столбик желатина.   Происходит разжижение (желатину разжижают Proteus vulgaris, Bacillus anthracis).
Молочный агар в чашках Петри имеет мутно-белый цвет. Появляются зоны просветления вокруг колоний на фоне мутно-белой среды.
Дезами-назы амино-кислот Среда с одной из аминокислот и индикатором рН; рН среды 7,2±0,2. Образуется аммиак, приводящий к защелачиванию среды и изменению цвета индикатора.
Декар-боксилазы Среда с одной из основных аминокислот (аргинином, лизином, орнитином, гистидином, тирозином, глутамином) и индикатором рН. При наличии декарбоксилазной активности среда подщелачивается за счёт образования диаминов, вызывая изменение цвета индикатора.
Трипто-фаназа Мясо-пептонный бульон или среда с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплённая под пробкой над питательной средой. Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой.
Десуль-фуразы (цисти-назы) Среды с цистеином, метионином и качественным реактивом на H2S – солями железа, свинца, висмута. Образуется H2S, который взаимодействует с Fe2+(Pb2+, Vi2+) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды.
Уреаза Среда с мочевиной и индикатором рН - феноловым красным, рН среды устанавливают 6,8±0,2. Образуется аммиак и окраска среды из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт сдвига рН в щелочную сторону.
ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Липаза Желточный агар или среда с твином-80. Липазы гидролизуют жиры на глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в проходящем свете на поверхности среды видна радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды).
Лецити-наза Желточный агар (к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-500С, добавляют источник лецитина - желток куриного яйца). Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназа есть у Staphylococcus aureus, клостридий, фузобактерий.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ (ОВФ)
Оксидаза Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу). При нанесении бакпетлей 18-24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовое окрашивание; используют для дифференциации Pseudomonas spр. (оксидазопозитивные) и энтеробактерий (оксидазонегативные).
Каталаза 3% раствор Н2О2; присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред. При нанесении на колонию перекиси водорода, либо при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазопозитивные) и Staphylococcus spp. (каталазонегативные).
Дегид-разы Сахарный полужидкий агар (донор водорода) с 1% метиленовым синим (акцептор водорода). Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается. Используют для определения бактериальной обсеменённости молока: подкрасив молоко метиленовой синькой, определяют время его обесцвечивания. Чем оно меньше, тем более обсеменено молоко. Качественное молоко долго остаётся синим.
Перокси-даза Используют бензидиновый тест: на предметное стекло наносят 4-6 капель суточной бактериальной культуры добавляют по 1-3 капли 2 % раствора метилпарааминофенол сульфата и 3% раствора Н2О2. В течение 5 – 10 мин бесцветная среда приобретает розовую или вишнёво-красную окраску. Положительная реакция характерна для Staphylococcus spp., отрицательная - Pseudomonas spp., Escherichia spp.
ФЕМЕНТЫ-ТОКСИНЫ
Гемо-лизины 5-10% кровяной агар. a-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок. b-гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний. g-гемолизины не дают видимого глазом гемолиза.
О-стрепто-лизин В пробирки с двукратными разведениями b-гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при 370С 1 час; параллельно ставят контроль из взвеси эритроцитов в питательном бульоне. В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в отрицательных случаях образуется осадок из эритроцитов. Определяют титр О-стрептолизина - наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз.
Плазмо-коагулаза Стерильная цитратная плазма крови, разлитая по 0,4 мл в пробирки. После внесения суточной агаровой культуры и инкубации посевов 2-5 часов при 370С происходит свёртывание плазмы и утрата ею текучести.
Гиалуро-нидаза Побирка с гиалуроновой кислотой и уксусная кислота; при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусной кислоты образуется сгусток муцина. Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 370С в пробирке с гиалуроновой кислотой и добавления 2-3 капель уксусной кислоты образуется сгусток муцина.
Нуклеазы МПА с ДНК, среда опалесцирует (полупрозрачна). Через 18-24 часа культивирования на среде после нанесения на ее поверхность 0,1% H2SO4 из-за деполимеризации ДНК и РНК вокруг колоний образуется прозрачный ореол - «венчик просветления».
Фибри- нолизин Сгустки фибрина. Растворение сгустков фибрина.
Цито-токсины Культура эпителиальных клеток или др. и токсин, выделенный путем фильтрования культуральной жидкости с использованием бактериальных фильтров. При культивировании культуры клеток с безмикробным фильтратом токсина культура клеток утрачивает типичную тканевую морфологию: округляется, ядра пикнотизируются.
Летучие жирные кислоты Газо-жидкостная хроматография кислото-эфирного экстракта ЛЖК из биологического материала или культуральной жидкости, содержащей анаэробы. На хроматограмме появляются пики в зависимости от массы и полярности вещества: чем легче вещество, тем раньше появляется пик на хроматограмме, поэтому ЛЖК выходят в следующей последовательности: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая (рис. 25). Изомасляная, изовалериановая, изокапроновая кислоты выходят раньше соответствующей кислоты.
         

 

 
 

Рис. 25. Хроматограмма выхода ЛЖК, отражающая зависимость времени выхода стандартного раствора смеси летучих жирных кислот от их молекулярной массы и полярности (чувствительность электрометра 1 10 – 9)

 

В последние годы в бактериологических лабораториях применяются одноразовые коммерческие тест-системы для биохимической идентификации. Они представляют собой пластиковые планшеты с лунками, заполненными дегидратированными субстратами с индикатором рН. Тест-системы позволяют изучать 20, 32, 64 биохимических признака (рис. 26).

Схема идентификации с использованием таких тест-систем включает следующие этапы:

1) выделение чистой культуры или изолированных колоний на плотной питательной среде;

2) приготовление бактериальной суспензии с определенной концентрацией микроорганизмов, которую определяют путем сравнения со стандартами мутности;

3) внесение суспензии микроорганизмов в лунки тест-системы;

4) инкубация в термостате от 4 до 24 часов (длительность зависит от тест-системы) при 370С;

5) учёт результатов, который может быть:

а) визуальным по изменению цвета индикатора;

б) автоматическим с использованием микробиологического анализатора.

6) анализ результатов с использованием компьютерного банка данных, включающего биохимические профили разных видов микроорганизмов. Результаты ферментации учитываются по принципу +/- и вносятся в референс-таблицу, после чего происходит сравнение с компьютерным банком данных. Идентифицируемый микроорганизм относят к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство и указывают степень сходства (в %). Хорошей идентификацией считается идентификация с 95% (и более) совпадением признаков.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.004 сек.)