АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Этапы секвенирования

Читайте также:
  1. I. Подготовительные этапы
  2. I. ЭТАПЫ ПРОТЕКАНИЯ КОНФЛИКТА
  3. I. Этапы развития бронхиальной астмы
  4. I.3. Основные этапы исторического развития римского права
  5. II. Организация и этапы статистического исследования
  6. II. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
  7. II. Этапы правления Александра I
  8. Автоматическое порождение письменного текста: определение, этапы, общая структура системы порождения
  9. Акмеизм как литературная школа. Основные этапы. Эстетика, философские источники. Манифесты.
  10. Антропогенез: биологические и социальные предпосылки эволюции человека, факторы и этапы его эволюции; расы, пути их формирования.
  11. Белорусская этносоциальная общность: сущность, этапы развития
  12. Бенчмаркинг: сущность, типы, этапы

1. Проведение ПЦР. Позволяет получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид.

2. Очистка амплифицированных фрагментов ДНК. Проводят очистку ампликонов от шлаков – остатков ПЦР реакции (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов).

3. Секвенирование. Проводят ряд последовательных стадий (рис. 38):

а) приготовление реакционной смеси, которая содержит:

- изучаемую ДНК,

- праймер,

- ДНК-полимеразу и буфер для неё,

- дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ),

- меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой для образования мостика между двумя нуклеотидами;

б) проведение реакции ПЦР-секвенирования;


Рис. 38. Этапы секвенирования

 
 
1. С помощью ПЦР получают множественные копии изучаемого гена, размер которых не должен превышать 1000 п. о. Образуемые в ПЦР ампликоны выявляют электрофорезом. 2. Ампликоны очищают от ПЦР-шлаков (праймеров, нуклеотидов).


       
 
3а, б. С помощью флуоресцентно меченых терминаторов синтеза ДНК-цепи, получают множество фрагментов ДНК, синтез которых оборван на аденине, тимине, гуанине, цитозине. Количество получаемых фрагментов ДНК равно сумме А, Т, Г, Ц, присутствующих в секвенируемом фрагменте.   3в. Проводят электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле, в котором разделяются фрагменты ДНК, отличающиеся в один нуклеотид.
   
А Ц Г Т А Ц Г Т 1 1 1 1 2 2 2 2 Образец 1 Образец 2
 



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |

Поиск по сайту:

Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.003 сек.)