АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов

Читайте также:
  1. II. Примеры
  2. Аудитория интернет-вещательных сайтов
  3. Безопасность сайтов
  4. Биохимические основы некоторых нервно-психических заболеваний
  5. Булевы функции. Способы задания. Примеры.
  6. В задачах 13.1-13.20 даны выборки из некоторых генеральных совокупностей. Требуется для рассматриваемого признака
  7. В некоторых видах продуктов, г на 100 г белка
  8. В некоторых монархических государствах употребляется тер-
  9. В некоторых странах, например в США, президента заменяет вице-
  10. Валентности и степени окисления атомов в некоторых соединениях
  11. Валеологическая оценка некоторых блюд и пищевых веществ
  12. Вопрос: Паблик рилейшнз в туризме. Примеры
Типы рестриктаз Рестриктаза Сайт распознавания
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов SmaI   5'...C C C^G G G...3' 3'...G G G^C C C...5'
SalI   5'...G^T C G A C...3' 3'...C A G C T^G...5'
XbaI 5'...T^C T A G A...3' 3'...A G A T C^T...5'
Стандартные рестриктазы HaeIII (BsuRI) 5'...G G^C C...3' 3'...C C^G G...5'

Примечание. ^ - место рестрикции.

II. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.

Молекулярная гибридизация - м олекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Методы молекулярной гибридизации позволяют в ыявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.

Варианты проведения молекулярной гибридизации.

1. В растворе.

2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.

3. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.

4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.

Этапы реакции гибридизации на мембранах:

А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.

Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.

В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:

– дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).

– саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.

Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.

Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:

– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;

– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;

– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.

Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).

 

Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.003 сек.)