Кінетика ферментативних реакцій. Під ферментативною кінетикою розуміють залежність швидкості реакції, що прискорюється ферментом, від хімічної природи реагуючих речовин (субстратів

Під ферментативною кінетикою розуміють залежність швидкості реакції, що прискорюється ферментом, від хімічної природи реагуючих речовин (субстратів, ферментів) і умов їх взаємодії (концентрації компонентів, температури, рН і складу середовища, наявності активаторів або інгібіторів і т. п.).

Вперше А. Браун (1902), а потім В. Анрі (1903) висловили гіпотезу про те, що в основі ферментативної реакції лежить обернена взаємодія субстратів з ферментом, внаслідок чого утворюються фермент-субстратні комплекси, які далі розщеплюються з утворенням продуктів реакції і регенерацією вихідного ферменту.

Ця гіпотеза була розвинена Л. Міхаелісом і М.Л. Ментен (1913), а пізніше Дж. Брігсом і Дж. Холдейном (1925), що привело до створення класичної ферментативної кінетики.

Відповідно до загального уявлення про механізм дії ферментів найпростіша ферментативна реакція з одним субстратом записується так:

де k₊₁ - константа швидкості утворення фермент-субстратного комплексу,

k_-1 - константа швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу на фермент і субстрат,

k₊₂ - константа швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворення продукту реакції і вивільненням ферменту.

На першій стадії біокаталітичного процесу відбувається утворення фермент-субстратного комплексу:

Ця рівноважна система може бути охарактеризована відповідною константою рівноваги. Величину, зворотну їй, називають константою дисоціації фермент-субстратного комплексу або субстратной константою і позначають Ks:

, моль/л

Субстратна константа залежить від природи субстрату і ферменту та відображає ступінь їх спорідненості. Чим нижче значення Ks, тим вища спорідненість ферменту до субстрату.

Оскільки концентрація фермент-субстратного комплексу змінюється внаслідок переходу останнього в продукт реакції з регенерацією вільного ферменту:

то значення Ks знаходять із співвідношення констант швидкостей прямої (k₊₁) і зворотної (k_–1) реакції, тобто:

.

Таким чином, субстратна константа, або константа дисоціації, фермент-субстратного комплексу (Ks) характеризує біокаталітичний процес з точки зору спорідненості ферменту і субстрату і співвідношення констант швидкості реакцій розпаду і утворення фермент-субстратного комплексу.

Оскільки одночасно з дисоціацією фермент-субстратного комплексу на вихідні речовини відбуваються перетворення субстрату на продукт і розпад фермент-продуктного комплексу на складові:

для повної характеристики ферментативного процесу введено поняття про константу Михаэлиса (Кm), яка представляє відношення констант швидкостей усіх трьох реакцій, що здійснюються в процесі ферментативного каталізу:

.

Кm завжди дещо вища за числовим значенням, ніж Ks. Так, Ks для комплексу сахарази і сахарози дорівнює 0,0167 М, а Кm складає 0,0280 М.

Швидкість хімічної реакції, що прискорюється ферментом (як і швидкість звичайної хімічної реакції), вимірюють кількістю молей субстрату, що перетворюється за одиницю часу.

Проте принципово важливо, щоб при цьому підтримувалися стандартні умови для прояву активності ферменту:

§ оптимальна температура,

§ оптимальне значення рН

§ і, що особливо важливо, повне насичення ферменту субстратом.

Швидкість ферментативної реакції, виміряної при дотриманні перерахованих умов, позначають і називають максимальною швидкістю ферментативної реакції.

Вона визначається концентрацією ферменту і константою швидкості розпаду фермент-продуктного комплексу:

.

Швидкість ферментативної реакції, що спостерігається за відсутності повного насичення ферменту субстратом, позначають v.

Математична обробка ферментативної реакції на основі закону діючих мас дала можливість вивести рівняння, назване на честь авторів рівнянням Міхаеліса-Ментен, яке виражає кількісне співвідношення між концентрацією субстрату та швидкістю ферментативної реакції:

де v - швидкість реакції при даній концентрації субстрату [ S ],

- максимальна швидкість реакції при повному насиченні ферменту субстратом;

K_s - константа дисоціації фермент-субстратного комплексу (субстратна константа), моль/л.

З рівняння Міхаеліса–Ментен витікає, що:

§ при високій концентрації субстрату та низькому значенні K_S швидкість реакції є максимальною (v = ), тобто весь фермент знаходиться у вигляді фермент-субстратного комплексу;

§ при низькій концентрації субстрату, навпаки, швидкість реакції виявляється пропорційною концентрації субстрату у кожний даний момент часу.

Рівняння Міхаеліса-Ментен в його класичному вигляді не враховує впливу на швидкість ферментативного процесу продуктів реакції, тому Дж. Брігс та Дж. Холдейн вдосконалили це рівняння (рівняння Брігса-Холдейна):

де K_m - константа Міхаеліса, моль/л.

Чисельно Кm дорівнює тій концентрації субстрату (у молях на літр), при якій швидкість ферментативної реакції (v) дорівнює половині від максимальної () (рис. 48).

Чим менша константа Міхаеліса, тим більша спорідненість ферменту до субстрату і реакція протікає швидко; якщо константа Міхаеліса велика, то спорідненість ферменту до субстрату низька і реакція протікає повільно, оскільки фермент-субстратний комплекс легко розпадається на складові.

K_m визначають графічно за результатами вимірювань швидкості реакції при різних концентраціях субстрату. Згідно рівняння Бріггса та Холдейна, залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату при незмінній концентрації ферменту графічно виражається наступним чином:

Рис. 48. Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату при постійній концентрації ферменту

При досягненні стану насичення ферменту субстратом швидкість ферментативної реакції досягає максимального значення і крива йде паралельно осі абсцис

При досягненні деякої концентрації субстрату, швидкість ферментативної реакції повинна досягати максимального значення і при подальшому збільшенні концентрації субстрату вже не змінюється.

Виходячи з рівняння та цього графіка можливо графічно визначити константу Міхаеліса, яка буде відповідати відрізку на осі абсцис, що відповідає швидкості, що дорівнює половині максимальній.

Але користуватись таким графіком, побудованим у прямих координатах незручно, тому що максимальна швидкість є асимптотичною величиною та визначається недостатньо точно.

Для визначення константи Міхаеліса та максимальної швидкості ферментативної реакції використовують метод подвійних обернених величин, що був запропонований А. Лайнуївером і Д. Берком у 1934 р. – якщо є рівність між двома величинами, то повинна бути рівність і між оберненими величинами:

Рівняння Лайнуівера–Берка – рівняння прямої лінії. Якщо побудувати графік в координатах 1/v (Y) від 1/[S] (Х), то матимемо пряму лінію, тангенс кута нахилу якої буде дорівнювати величині .

Відрізок, що відсікає пряма від осі ординат, дорівнює величині 1/V_max, а продовження прямої відсікає на осі абсцис відрізок, що дорівнює величині -1/К_m.

Поиск по сайту: