ВИЧ–инфекция

Большинство поражений полости рта при ВИЧ-инфекции сопровождается образованием изъязвлений, которые развиваются у 50% инфицированных и у 80% больных на стадии СПИДа.

Среди возбудителей, поражающих слизистые оболочки полости рта, основное значение имеют вирусы семейства Herpesviridae: вирусы простого герпеса, опоясывающего лишая, цитомегалии, вирус Эпштейна- Барр.

Вирусные стоматиты у ВИЧ-инфицированных протекают в тяжелой форме и часто осложняются бактериальными суперинфекциями. Из-за сильных болей при изъязвлении слизистых оболочек нарушаются процессы жевания и проглатывания пищи, что усугубляет истощение.

Активная репродукция вируса Эпштейна – Барр в клетках эпителия языка приводит к особому типу поражения – «волосатой» лейкоплакии. Волосатая лейкоплакия характеризуется образованием выпуклых белых бляшек, расположенных обычно по краям языка. При этом пораженные участки покрыты вертикальными бороздками, придающими ей складчатый вид. Бляшки обнаруживаются также на спинке и нижней поверхности языка, на слизистой щек и неба. В этих местах бляшки плоские и гладкие. Как правило, волосатая лейкоплакия не требует лечения.

У 40-60 % ВИЧ-инфицированных выявляются грибковые поражения слизистой ротовой полости. Основной возбудитель – Candida albicans, часто он обнаруживается в ассоциациях с другими видами – С. tropicalis, C. parapsilosis и др. Кандидозные инфекции протекают в виде молочницы, ангулярного хейлита, атрофического и хронического гиперпластического кандидозов. При атрофическом кандидозе на твердом небе и спинке языка формируются ярко-красные очаги поражения. Хронический гиперпластический кандидоз характеризуется симметричным расположением красных и белах пятен на слизистой оболочке щек. При ангулярном хейлите в углах рта появляются покраснения и трещины.

У ВИЧ-инфицированных помимо банальных стафилококковых и стрептококковых инфекций, развиваются некротизирующие гингивиты и периодонтиты, вызываемые видами микроорганизмов из различных родов и семейств: Mycoplasma salivarium, Pseudomonas spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp.

У трети больных СПИДом слизистая полости рта является местом первичной сосудистой опухоли – саркомы Капоши. В процесс часто вовлекаются твердое небо и прилегающие к нему десны, однако язык, губы и слизистая щек поражаются редко. Поражения обычно безболезненны, некоторые очаги могут изъязвляться и кровоточить. Саркома Капоши может сочетаться с кандидозным стоматитом.

Корь.

Своеобразные стоматологические проявления характерны для коревой инфекции. При этом заболевании в продромальном периоде на слизистой оболочке щек появляются пятна Филатова-Коплика. Они возникают за 2-3 дня до появления сыпи на коже задних отделов слизистых щек на фоне ограниченной эритемы неправильной формы. Пятна беловато-желтоватого цвета, величиной с булавочную головку, возвышаются над уровнем слизистой и имеют плотную консистенцию. При попытке снять их шпателем не удаляются и исчезают до появления коревой сыпи на коже. Пятна Филатова-Коплика очень типичны и позволяют проводить раннюю диагностику кори, следовательно, своевременно изолировать больного.

Ящур.

Эта болезнь встречается у людей крайне редко. Человек заражается от больных животных при употреблении мяса и молока, реже контактным и воздушно-капельным путем. На фоне общей слабости, головной боли и боли в мышцах, повышения температуры в полости рта появляется жжение и обильное слюноотделение. Спустя один или два дня возникает гиперемия и отек слизистой, появляются небольшие пузырьки на языке, деснах, небе, губах, реже на слизистой оболочке носа. Пузырьки вскрываются и на их месте образуются афтоподобные элементы. Поражение ротовой полости часто сочетается с поражением кожи в межпальцевых складках, оснований ногтей, коже подошв.

РАЗДЕЛ III. ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

ПО МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ПЕРЕЧЕНЬ ЗАДАНИЙ

1. Определить морфологию микроорганизмов (по готовым мазкам).

Морфологию микроорганизмов определяют путем микроскопии мазков в световом микроскопе с иммерсионной системой.

На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на столик микроскопа и под контролем зрения опускают иммерсионный объектив в масло. Макровинтом находят поле зрения, затем микровинтом устанавливают четкость изображения. Изучают форму (кокки, палочки, спирохеты), размеры, расположение микроорганизмов. В зависимости от способа окраски выявляют дополнительные структуры (капсулу, споры, зерна волютина и т.д.).

2. Определить морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов (по готовым мазкам).

Взять предметное стекло с готовым микропрепаратом, окрашенным по Граму. Нанести на препарат каплю иммерсионного масла. Провести микроскопию в световом микроскопе с увеличением объектива 90.

Определить форму микробных клеток и отношение к окраске по Граму.

3. Приготовить мазок из агаровой культуры, окрасить по Граму. Определить морфологические и тинкториальные свойства.

Стекло обезжиривают мылом, ограничивают стеклографом место для нанесения мазка с обратной стороны от обезжиривания. Стерильной бактериологической петлей на стекло наносят каплю физиологического раствора.

Пробирку с агаровой культурой бактерий берут в левую руку, а петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее IV и V пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку со скошенным агаром, охлаждая петлю о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и закрывают пробкой.

Петлей с культурой прикасаются к капле физиологического раствора до появления легкого помутнения. Избыток культуры сжигают в пламени спиртовки, после чего петлю охлаждают прикосновением к стеклу и равномерно распределяют каплю по стеклу в виде круга. Мазок высушивают, фиксируют трехкратным проведением препарата через пламя горелки. Окрашивают мазок по Граму: наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную карболово–спиртовым раствором генцианового фиолетового, дистиллированную воду на 1–2 минуты, снимают фильтрованную бумагу, наносят раствор Люголя на 1–2 минуты, сливают его и наливают пипеткой этиловый спирт на 30 секунд. Тщательно промывают водой, докрашивают водным раствором фуксина 1–2 минуты. Промывают и высушивают мазок. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

4. Произвести бактериоскопическое исследование гноя и определить морфологию и тинкториальные свойства имеющихся микроорганизмов.

Взять чистое предметное стекло, произвести обезжиривание его натиранием кусочком сухого мыла, мыло со стекла тщательно удалить с помощью ваты. Место мазка на стекле обозначить карандашом-стеклографом в виде овала в центре стекла площадью примерно 1/3 предметного стекла. Овал начертить на стороне, обратной обезжиренной.

Взять в правую руку бактериальную петлю, простерилизовать в пламени горелки. В левую руку взять пробирку с гноем. Мизинцем правой руки плотно захватить наружный конец ватной пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынуть пробку из пробирки. Обжечь край пробирки в пламени спиртовки. Опустить петлю в пробирку, остудив о стенку, взять материал. Вынуть петлю из пробирки. Быстро обжечь край пробирки и внутреннюю часть пробки. Пробирку закрыть пробкой, поставить в штатив.

На предметное стекло в центр овала внести каплю гноя и равномерно круговыми движениями распределить по всей площади овала. После этого петлю тотчас же, не выпуская из рук, простерилизовать в пламени горелки.

Мазок высушить при комнатной температуре на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.

Сухой мазок зафиксировать нагреванием на пламени горелки. Стекло держать за край мазком вверх и 3 раза провести через среднюю часть пламени.

Зафиксированный мазок окрасить по Граму (см. это в вопросе №3).

На окрашенный препарат нанести каплю иммерсионного масла. Провести микроскопию в световом микроскопе с увеличением объектива 90.

Определить форму микробных клеток и отношение к окраске по Граму.

5. Сделать посев исследуемого материала петлей на жидкую и плотную питательные среды.

Пробирку с исследуемым материалом берут в левую руку, а петлю за петледержатель – в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и закрывают пробкой. Далее в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Открывают пробирку с жидкой средой и вносят материал петлей в верхнюю часть жидкой среды. Пробирку закрывают как описано выше.

6. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры, оценить культуральные свойства по готовым посевам.

Бактериологическую петлю стерилизуют в пламени спиртовки (до ее покраснения). Над пламенем спиртовки открывают пробирку с исследуемым материалом. Мизинцем и ладонной поверхностью правой кисти зажимают пробку и вынимают ее. Обжигают края пробирки и пробку, петлю держат как писчее перо. Погружают петлю в исследуемый материал после ее охлаждения в пробирке. Извлекают петлю материала, закрывают пробку над пламенем спиртовки и ставят ее в штатив. Слегка открывают чашку Петри. Для разобщения микробных клеток материал распределяют петлей параллельными штрихами на обе половины чашки. Закрытую чашку, дном кверху, помещают в термостат на 24 часа. Оценку культуральных свойств проводят с учетом величины, пигмента, формы, края колонии и консистенции колонии.

7. Произвести посев на косой агар с целью выделения чистой культуры микроорганизмов.

Берут чашку Петри с МПА с ростом колоний. Отмечают на дне чашки изолированную колонию. Стерилизуют бактериальную петлю в пламени спиртовки. Левой рукой открывают чашку Петри, на бортике чашки охлаждают бактериальную петлю. Петлей снимают часть отмеченной колонии, чашку Петри закрывают.

Берут в левую руку пробирку со скошенным агаром и мизинцем правой руки плотно захватывают наружный конец ватной пробки, прижав ее к ладонной поверхности руки, и вынимают пробку из пробирки. Обжигают край пробирки в пламени горелки. Опускают петлю с взятой колонией бактерий до конденсационной воды у дна пробирки и проводят зигзагообразную линию, скользя петлей по поверхности агара от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи от конденсационной воды до верхней части косого агара. Вынимают петлю из пробирки. Быстро обжигают край пробирки и внутреннюю часть пробки. Пробирку закрывают пробкой. Прокаливают петлю в пламени и ставят ее в штатив. Засеянную пробирку подписывают, ставят в штатив, который помещают в термостат.

8. Сделать посев исследуемого материала на чашку с МПА сплошным газоном.

Один мл исследуемого материала набирают стерильной пипеткой и выливают в чашку Петри (слегка открыв ее). Легким покачиванием чашки распределяют материал по всей поверхности агара.

9. Сделать посев для определения биохимических свойств выделенной культуры.

Чистую культуру с косого агара засевают петлей в среды «пестрого» ряда (пептонная вода, 1% раствор глюкозы, лактозы, сахарозы, маннита, мальтозы, индикатор Андреде и поплавок для улавливания газа) и МПБ. Для этого стерилизуют бактериологическую петлю (до покраснения) в пламени спиртовки. В левой руке держат 2 пробирки (первая - косой агар с чистой культурой, вторая - с одной из питательных сред). Вынимают пробки из пробирок мизинцем и ладонной поверхностью кисти над пламенем горелки. Петлю опускают в пробирку с культурой, после ее остывания берут исследуемую культуру методом соскоба, извлекают из пробирки, вносят поочередно в среды «пестрого» ряда и МПБ. В среду с МПБ после посева культуры помещают индикаторные бумажки, смоченные щавелевой кислотой для выявления индола и раствором уксуснокислого свинца для выявления сероводорода, и закрепляют их у пробки.

10. Выполнить 1 этап бактериологического исследования испражнений больного при подозрении на дизентерию.

Произвести посев испражнений петлей в чашку Петри с питательной средой Плоскирева (технику посева и состав среды см. в вопросах №№6 и 24).

11. Определить вид микроба по антигенным свойствам в реакции агглютинации с адсорбированной агглютинирующей сывороткой.

Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия (контроль), а на другую – каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютинации в пробах. Учет производят через 3-5 мин.

12. Поставить и оценить ориентировочную реакцию агглютинации для определения вида микроба.

Берут предметное стекло, делят стеклографом на две части: опытную (о) и контрольную (к). На опытную часть пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей сыворотки в разведении 1:5, на контрольную – каплю физиологического раствора. Затем в каждой капле тщательно размешивают небольшое количество культуры бактерий до получения гомогенной взвеси. Бактерии вносят прокаленной и остуженной бактериальной петлей. Петля стерилизуется после каждой капли. Результат наблюдают через 1-2 мин. Контрольная капля остается равномерно мутной. В опытной капле в положительном случае наблюдается склеивание бактерий в виде мелких зернышек.

После учета реакции предметное стекло опускают в стакан с дезинфицирующим раствором.

13. Оценить результаты РСК с целью определения антител в сыворотке больного по демонстрационному ряду.

Взять ряд пробирок с разведениями сыворотки больного: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 и контролями гемолитической системы, антигена и комплемента.

Учет начать с контрольных пробирок. В пробирке контроля гемолитической системы выявить отсутствие гемолиза, в контролях антигена и комплемента – гемолиз. В опытных пробирках определить отсутствие или наличие гемолиза.

При отсутствие гемолиза РСК положительная. При наличии гемолиза РСК отрицательная. В положительном случае дать заключение о наличии в сыворотке больного специфических антител и определить их титр, т.е. наибольшее разведение сыворотки больного, при котором отсутствует гемолиз.

14. Поставить реакцию преципитации для определения антигена в ликворе больного.

Взять пробирку и осторожно по стенке внести пастеровской пипеткой около 0,5 мл преципитирующей менингококковой сыворотки. Затем аккуратно наслоить на сыворотку такое же количество ликвора так, чтобы ликвор не смешивался с сывороткой, а образовал над ней верхний слой. Пробирку поставить в штатив. При положительном результате сразу на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо преципитации.

15. Оценить РПГА для определения наличия столбнячного токсина в фильтрате исследуемого материала (по демонстрационному материалу).

Оценивают результаты РПГА по характеру осадка эритроцитов. Отрицательная реакция – осадок компактный в виде колечка с ровными краями, «пуговица», положительная – характерный кружевной осадок в виде зонтика. Титр токсина – предельное разведение фильтрата, дающее положительный результат.

16. Поставить РГА для индикации и титрования вируса. Оценить реакцию по демонстрационному ряду.

Постановка реакции гемагглютинации для индикации и титрования вируса.

Разведения	1:5	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	К
Физ.раствор	0,8	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Аллантоисная жидкость	0,2	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	-
Взвесь эритроцитов	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0.4	0,4
Результат
Заключение:

Максимальное разведение аллантоисной жидкости, еще дающее гемагглютинацию (осадок в форме зонтика), принимается за титр гемагглютинирующего вируса.

17. Поставить РТГА для определения типа вируса в аллантоисной жидкости.

Реакцию ставят по следующей схеме:

	Ингредиенты разведения	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	К
Физ. раствор	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Противогриппозная сыворотка А (Н3N2) 1:5 титр сыворотки 1:320	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Противогриппозная сыворотка А (H2N2) 1:5 титр сыворотки 1:320	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Аллантоисная жидкость 4ГАЕ	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Взвесь эритроцитов	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Термостат 37о С 2 часа
Результат А (Н2N2)
Результат А (Н3N2)
Заключение:

Если торможение гемагглютинации (осадок в форме пуговицы или кольца) пройдет до титра диагностической сыворотки или его половины, то вирус соответствует диагностической сыворотке.

18. Оценить РТГА в парных сыворотках больного с целью серодиагностики вирусных инфекций.

Берут 2 ряда пробирок с разведениями сыворотки больного: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, К (контроль). Учет начинают с контрольных пробирок, в которых должен быть осадок эритроцитов в виде «зонтика». Затем сравнивают результаты опытных пробирок с контролем. При наличии осадка эритроцитов в виде «пуговки» результат оценивается положительно, при наличии «зонтика» - отрицательно.

Определяют титры антител в двух рядах сыворотки и сравнивают.

Для серологического подтверждения вирусной инфекции титр антител во II-й сыворотке, взятой в конце заболевания, должен возрасти не менее, чем в 4 раза по сравнению с I-й сывороткой больного.

19. Поставить РПГА для определения титра антител в сыворотке больного. Оценить реакцию по демонстрационному ряду.

Используют стандартные антигенные эритроцитарные диагностикумы. В пробирках готовят последовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую пробирку вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов (эритроцитарного диагностикума). Через 2 ч инкубации при 37⁰С учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательная реакция – осадок эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дна лунки, положительная реакция – характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

20. Определить титр антител в ИФА по демонстрационному материалу.

Сначала оценивают контрольные пробы:

1. Отрицательная проба – лунка, в которой цвет пробы прозрачный со слегка желтоватым оттенком.

2. Положительная проба – лунка, в которой цвет среды коричневый.

После этого учитывают лунки, в которых находятся разведения исследуемой сыворотки (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). За титр антител принимают последнее разведение, в котором цвет пробы совпадает с цветом положительной пробы.

21. Поставить опыт по определению чувствительности культуры микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков. Оценить опыт по демонстрационным посевам.

Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри. Для этого извлекают из бумажной упаковки стерильную пипетку, ее берут в правую руку. В левую руку берут пробирку с 1 млрд взвесью бактериальной культуры, открывают над спиртовкой пробку 4 –5 пальцами правой кисти. Набирают в пипетку 1 мл культуры, располагают пипетку горизонтально (чтобы случайно не вылить содержимое на стол), обжигают края пробирки и закрывают ее пробкой. Приоткрыв чашку Петри с МПА, выливают 1 мл культуры на агар. Чашку закрывают и распределяют культуру по поверхности агара, оставляют на несколько минут (для всасывания жидкости) на столе. Затем на поверхность питательной среды пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37⁰С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста культуры судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром 0-10 мм культура расценивается как нечувствительная (устойчивая), диаметром 11–15 расценивается как малочувствительная, 16-25 мм – чувствительная, больше 25 мм – высокочувствительная.

22. Определение МПК (минимальной подавляющей концентрации) антибиотика методом серийных разведений в бульоне (по демонстрационному ряду).

Из основного раствора, содержащего определенную концентрацию антибиотиков, готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном и добавляют испытуемую культуру (обычно 10⁵-10⁶ бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Срок инкубации зависит от вида микроорганизмов (чаще сутки). Определяют МПК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда).

23. Среда Эндо.

Среда Эндо – МПА, 1% лактоза, индикатор (основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия). Колонии микроорганизмов, разлагающих лактозу, приобретают цвет индикатора (красные).

24. Среда Плоскирева.

Используется для выращивания шигелл. Состав: МПА, лактоза, соли желчных кислот и бриллиантовая зелень (для угнетения роста кишечной палочки), индикатор нейтральный красный. Шигеллы не разлагают лактозу, дают рост бесцветных, лактозоотрицательных колоний.

25. Среда Гисса.

Среды Гисса используют для изучения биохимических свойств выделенной культуры. Они представлены рядом пробирок с пептонной водой, 1% раствором углевода (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, спирт маннит), индикатором Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный 1М NаOH), поплавком для улавливания газа. Если углевод разлагается до кислоты, щелочь нейтрализуется, фуксин восстанавливается, среда краснеет, если до газа, то в поплавке появляется пузырек газа.

26. Среда Китта–Тароцци.

Используется для выращивания строгих анаэробов, состоит из МПБ, кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода из среды, глюкозы (источник энергии), сверху залита вазелиновым маслом для защиты от кислорода.

27. Среда Ресселя.

Сложная дифференциально-диагностическая среда. Состоит из МПА, 1% лактозы, 0,1% глюкозы и индикатора. Среда имеет форму полускошенного агара.

Применяется для выделения чистой культуры бактерий и дифференциации их по биохимическим свойствам.

28. Среда Кесслера.