 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Приложение к занятию 11
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР) |
| Впервые описана в 1985 году Saiki и соавторами. Сущность метода: Это циклический процесс увеличения в геометрической прогрессии копий определенного фрагмента ДНК, протекающий под воздействием термостабильной ДНК-полимеразы и при строго заданных временных и температурных режимах. В качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы используют 2 олигонуклеотида-праймера, способные специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах 2-х цепей участка ДНК. В ходе повторяющихся циклов: а) Денатурация ДНК (температурная или щелочной гидролиз) б) Отжиг праймеров в) Синтез комплементарных матрице, ограниченной праймерами, цепей с помощью ДНК-полимеразы. Экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответствующих первичной структуре праймеров. В результате 30-ти циклов амплификации на базе одной молекулы ДНК можно получить более1 млн. копий необходимого участка ДНК - количества, достаточного для анализа с помощью других молекулярно-биологических методов (молекулярная гибридизация, гельэлектрофорез в присутствии бромистого этидия и др.) Метод используется для диагностики многих вирусных инфекций в случаях недостаточного количества исследуемого материала; позволяет выявить нуклеиновые кислоты возбудителя не только из свежего материала, но и из высушенных и даже фиксированных препаратов; при отсутствии в крови Ат или при их недостаточном уровне для проведения серодиагностики. Например. ПЦР позволяет обнаружить геном ВИЧ, встроенный в геном пораженных лимфоцитов в случаях невозможности использования серологических методов. |
| Генная инженерия: Клонирование генов |
| Клонирование генов - это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения либо: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде. Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий: 1. Получение необходимого гена а) Путем расщипления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщипляющие молекулу ДНК в строго определенном месте). б) Путем химического синтеза только небольшие фрагменты ДНК (т.к. зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина. в) Из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) снимают ДНК-копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина, из клеток, инфицированных вирусами РНК синтеза интерферона. 2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК - получение рекомбинантной ДНК. Вектор - это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам); и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги. Плазмиду расщипляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщипления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы до-ращивают так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраи-ваемой (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК-лигаз осуществ-ляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК. Полученная в ре-зультате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК. 3. Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культиворование не представляет большой проблемы (E. coli, В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1. а) то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофаг). 4. Отбор трансформированных бактерий. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а следовательно бактерии, содержащие плазмиды будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика. 5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах. 6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид |
| Получение моноклональных антител (МКА) |
| Основные методы современной клеточной инженерии - гибридизация (или фузия) и реконструкция клеток. Метод гибридизации клеток позволяет соединить воедино клетки даже совершенно различных микроорганизмов и даже слияние клеток растений, животных и человека. Фузия клеток осуществляется либо обработкой клеток полиэтиленгликолем, либо действием коротких электрических импульсов. Полученные в результате гибридные клетки - гибридомы имеют два набора хромосом и сочетают в себе свойства обеих «родительских» клеток. В 1974 г. Милстайн и Келлер осуществили гибридизацию нормальных лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши с миеломными клетками мыши. Продукт слияния антителопродуцирующих клеток с опухолевыми - гибридома, продуцирующая антитела одной специфичности (к одной антигенной детерминанте) и способная к неограниченному росту in vitro. МКА широко используются для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций (гепатит В, грипп, герпес, бруцеллез); определения тканевых антигенов, рецепторов и медиаторов лимфоцитов; для диагностики и лечения злокачественных опухолей (созданы МКА, реагирующие со специфическими Аг рака легких, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы). |
Темы докладов для учебной конференции:
1. История развития биотехнологии.
2. Биотехнология и разрешение экологических проблем.
3. Биотехнология: новые возможности в диагностике и лечении.
4. Новые лечебные препараты.
5. Возможности и перспективы генной инженерии.
Дополнительная литература
- Сатаров С., Суворов А.Н. Идентификация сальмонелл методом экспресс-полимеразной цепной реакции //ЖМЭИ.1997. № 1.С. 63 - 66.
- Жаданова Л.В., Романова Ю.М., Бондаренко В.М., Константинова Т.Е., Шевелев А.Б. Клонирование генов лизоцима и лизостафина Staphylococcus aureus и их экспрессия в клетках Bacillus subtili.s //ЖМЭИ. 2001. № 1.С. 3 – 7.
Поиск по сайту: