Молекулярная диагностика заболеваний

Большинство методов диагностики инфекционных и генетических заболеваний основано на обнаружении в крови больного человека или животного специфических антител, образующихся в ответ на действие антигенов. Получение моноклональных антител является результатом культивирования изолированных клеток млекопитающих. За разработку метода моноклональных антител – одного из самых важных методических достижений в медицинской биологии в 70-е годы Цезарю Мильштейну и Георгу Кёлеру в 1984 году была присуждена Нобелевская премия Эту премию они разделили вместе с иммунологом Н.Ёрне.

Принцип получения и применения моноклональных антител

При традиционном методе иммунизации для получения антисывороток с высоким содержанием антител необходимо использовать антиген высокой степени чистоты и в большом количестве. Не во всех случаях удается получить чистый антиген. В результате животному вводится гетерогенная смесь биополимеров, поэтому в полученной антисыворотке необходимых антител будет лишь определенная доля. Кроме того, каждый лимфоцит и его клон синтезирует только один тип антител. Таким образом, гетерогенность антител в иммунной сыворотке определяется и функционированием гетерогенных по составу β-лимфоцитов. В целом разнообразие антител, которые вырабатывает организм животного, определяется как 10⁷. К сожалению, лимфоциты не растут вне организма – в условиях in vitro, но индуцировать их к такому росту можно в результате слияния с миеломными клетками. Миеломы – это злокачественные новообразования иммунной системы, которые развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов.

Клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки, поэтому осуществить их слияние между собой относительно несложно. Разработаны различные методы слияния клеток. Первый из них основан на использовании инактивированного вируса Сендай. Этот вирус относится к группе парамиксовирусов, его вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, сливающейся с мембраной клетки-хозяина и обеспечивающей проникновение вируса в клетку Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток. Кроме того для слияния используют и химические вещества: ионы кальция, лизолецитин, ПЭГ (полиэтиленгликол). Образовавшиеся гибридные клетки отбирают на селективном фоне.

Мильштейном был использован следующий принцип получения гибридных клеток – гибридом (рис.5).

· при наличии ПЭГ производится слияние нормальных лимфоцитов из иммунизированных животных и клеток миеломы. Миеломные клетки должны быть генетически маркированы с тем, чтобы они погибали на определенной селективной среде. Например, они могут быть недостаточны по одному из ферментов пуринового обмена - ГПВРТ, а селективная среда содержит амноптерин, блокирующий синтез нуклеотидов;

· Продукт слияния помещают на селективную среду, где выживают только гибридные клетки, так как нормальный лимфоцит привносит в гибридому недостающий фермент, а миелома – фактор неограниченного роста в культуральных условиях;

· Выжившие гибридомы проверяют на способность синтезировать антитела определенной специфичности;

· Проводят клонирование, получая из каждой необходимой гибридной клетки клоны. Клоны размножают.

Рис. 5. Метод получения гибридных клеток – гибридом по Мильштейну

Антитела, производимые такими клонами, называют моноклональными потому, что они синтезируются потомками единственной В-клетки, ставшей "бессмертной" благодаря гибридизации с опухолевой миеломной клеткой.

Моноклональные антитела используют в диагностике, при установлении характеристик тканей и органов, предназначенных для трансплантации.

Таблица 2.

Возможные способы применения моноклональных антител

Поиск по сайту: