Трансгенные растения

Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например, клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия, находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток любых типов, а также давать начало новым растениям.

Перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре недифференцированной ткани каллуса. Такие клетки могут стабилизироваться в жидких суспензионных культурах и расти неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов растений можно легко регенерировать целые растения.

Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.

Рис. Увеличение относительной площади выращивания трансгенных культур в развивающихся странах

Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам.

Метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов предложен В. Шибальским в 1988 г. Сущность метода заключается во введении в геном растений трансдействующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "антигенов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. С использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX). В этом случае в ген репликазы PVX с помощью направленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX.

Рис. Площади возделывания основных трансгенных растений

Еще один подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. С использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV). Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса.

Трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц – 1,5-3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции.

Упаковка рекомбинантных ДНК в липосомы позволяет защитить генетический материал от разрушающего действия нуклеаз, находящихся в клетках. Липосомы – это сферические образования, состоящие из фосфолипидов. Для введения ДНК в клетки растений наиболее пригодны липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина.

Для получения протопластов их обрабатывают веществами, ингибирующими синтез клеточной стенки. После слияния гибридные протопласты помещают в среду, в которой нет ингибитора синтеза клеточной стенки, и клетки начинают нормально развиваться.

Микроиньекции ДНК в протопласты осуществляются микроиглой диаметром 2 мкм.

Метод электропорации предпологает создание специальных пор в клеточной мембране реципиентной клетки с помощью пульсирующего электрического поля. Через эти поры в клетку могут входить ДНК,РНК, белки и пр.

Иногда используют векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений.

Бомбардировка микрочастицами, или метод биологической баллистики, основан на «вбрасывании частиц вольфрамата (диаметр 0,6-1,2 мкм) в клетки суспензионных или каллусных культур с напылением на них ДНК-вектора с генетической конструкцией.

В качестве вектора для переноса генов в растения используется Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens – почвенной бактерии, вызывающей корневой рак у двудольных растений. Ti-плазмида способна встраиваться в растительные хромосомы и переносить гены, необходимые для трансформации растительных клеток в двудольные растения.

Главное:

- Генетическая (генная) инженерия позволяет путем операций в условиях in vitrо переносить генетическую информацию из одного организма в другой, используя для этого функционально активные генетические структуры – рекомбинантные дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК).

- Рекомбинантные (или гибридные) ДНК образуются при объединении фрагментов ДНК, выделенных из различных организмов.

- В создании рекомбинантных ДНК участвуют различные ферменты: рестриктазы, ДНК-лигазы, ревертазы, ДНК-полимеразы.

- Генная инженерия основана на получении гибридных молекул ДНК и введении этих молекул в клетки других организмов.

- Векторы – это молекулы ДНК, способные соединяться с чужеродной ДНК, переносить ее в другую клетку и обеспечивать репликацию (воспроизведение). В качестве векторов в генно-инженерных работах чаще всего используют ДНК плазмид и вирусов.

- Основной единицей наследственности организма является ген-участок молекулы ДНК, находящийся в хромосоме.

- Процесс синтеза соответствующих генов зависит от работы промотора-участка молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза.

- Экпрессия генов в бактериальных клетках регулируется уровнем ДНК, РНК, белка.

- Трансгенных животных получают благодаря ретровирусным векторам, микроиньекциям ДНК, модифицированным эмбриональным стволовым клеткам, переносу генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом и клонированию с помощью переноса ядра.

- Для получения трансгенных растений используют Ti-плазмид почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes, векторы на основе вирусов, производят бомардировку микрочастицами, прямое введение генов в протопласты растений, микроиньекции, электропорацию и слияние липосом.

Контрольные вопросы:

1. Что такое вектор?

2. Что можно использовать в качестве векторов?

3. Какими свойствами должен обладать вектор?

4. Чем обусловлена популярность плазмидных векторов?

5. Что происходит в результате трансформации?

6. Каким образом проводят идентификацию клеток, содержащих реципиентные гены?

7. Какие методы, повышающие эффективность экспрессии чужеродных генов, чаще всего используются?

8. Клонирование в бактериях.

9. Что такое челночный вектор?

10. Клонирование в дрожжах.

11. Клонирование в клетках животных.

12. Расскажите о технологии микроинъекции ДНК.

13. Что такое трансгенный организм?

14. Что такое мозаики в трансгенных линиях? Чем обусловлено это явление?

15. С какой целью получают трансгенных животных?

16. С какой целью получают трансгенные растения?
Раздел 5

Поиск по сайту: