ДНК-пробы

К ДНК-пробам относятся любые препараты меченой ДНК, которые могут быть использованы для проведения гибридизации in situ: клонированные фрагменты ДНК, ДНК отдельных хромосом и хромосомных районов, а также геномная ДНК интересующего исследователя образца. Минимальные размеры последовательности ДНК, которую можно использовать для FISH зависят от чувствительности системы детекции и числа копий этой последовательности, если в образце она такая последовательность повторена многократно, и ее копии локализованы близко друг к другу. Рассматривая возможности современной FISH, следует отметить, что существует возможность локализации с ее помощью уникальных последовательностей размером менее сотни пар нуклеотидов. Однако, это требует использования очень сложной системы детекции, включающей создание в районе ее локализации специальной генно-инженерной структуры, обеспечивающей наработку меченой ДНК с помощью phi29 ДНК-полимеразы. Из-за сложности и дороговизны этого метода он, практически не используется в современной диагностике. Стандартные методы FISH позволяют проводить локализации уникальных последовательностей ДНК размером не менее 1000 пар оснований. Но в диагностике обычно используются более протяженные фрагменты ДНК, состоящие из десятков и тысяч пар оснований. Это обеспечивает выявление интенсивного и надежного сигнала.

Эти ДНК пробы представляют собой не единую молекулу, а множество фрагментов ДНК размером менее тысячи пар оснований, которые относительно равномерно покрывают последовательность ДНК пробы, даже если она представляет целую хромосому или ее протяженный район. Проведение FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб с метафазными хромосомами в отличие от ДНК-проб, приготовленных на базе клонированных последовательностей, как бы окрашивает всю соответствующую хромосому (рис. 1). В связи с этим, такие пробы в англоязычной литературе получили название Whole Chromosome Paints – WCPs. Проведение FISH таких ДНК-проб имеет ряд особенностей. Хромосомы человека содержат множество повторенных последовательностей ДНК, в том числе и последовательностей, распределенных по всей длине хромосом. Так как хромосомоспецифичные ДНК-пробы индивидуальной хромосомы представляет значительную часть ее ДНК, в ее состав входят меченые повторенные последовательности, присутствующие и в других хромосомах. Причем число копий этих повторов в составе хромосомоспецифичной ДНК-пробы многократно больше, чем число копий любой уникальной последовательности. В связи с этим постановка FISH в обычном варианте приведет к интенсивному сигналу во всех хромосомных районах. Для выявления специфичного сигнала необходимо вывести из гибридизации с ДНК хромосом фрагменты, содержащие повторенные последовательности. Это возможно сделать, либо предварительно удалив из хромосомоспецифичных ДНК-проб повторенные последовательности, либо предотвратив их гибридизацию с ДНК хромосом. В практической диагностике используется второй подход. Для этого меченая ДНК перед гибридизацией отжигается с 50-100 кратным избытком немеченой Cot1 ДНК человека (фракция высокоповторенной ДНК человека). В результате этого отжига основная масса фрагментов меченой повторенной ДНК переводится в двухнитчатую форму и, таким образом, предотвращается ее гибридизация с ДНК хромосом, интерфазных ядер, распластанного хроматина находящейся на цитологическом препарате. Cot1 ДНК человека коммерчески доступна как и хромосомоспецифичные ДНК-пробы. FISH c супрессией гибридизации диспергированных повторов получил широкое распространение при диагностике хромосомных патологий и свое собственное название: Chromosomal In Situ Suppression hybridization (CISS-гибридизация).

Использование стандартных наборов реактивов и ДНК-проб обычно гарантирует получение надежных и воспроизводимых результатов, тем не менее, для их адекватной оценки необходимо учитывать ряд факторов. Хромосомоспецифичные ДНК-пробы могут быть получены разными методами, что отражается на их составе и на конечных результатах FISH. В настоящее время большинство коммерчески доступных хромосомоспецифичных ДНК-проб производят путем амплификации ДНК индивидуальных хромосом, сортированных помощью проточной цитометрии, а амплификация ДНК выполняется в полимеразной цепной реакции, обеспечивающей ее секвенснезависимую амплификацию [44; 48].

Проточная цитофлуорометрия в комбинации с сортером позволяет выделять индивидуальные хромосомы из смеси метафазных хромосом. Принцип работы этого комплекса приборов заключается в идентификации окрашенной флуорохромами хромосомы по уровню ее свечения, вызванному облучением лазерами, выделении ее в микрокапле и направлении этой микрокапли по определенной траектории в соответствующую ловушку. Пример распределения индивидуальных хромосом человека по интенсивности свечения при окраске Hoechst 33258 и хромомицином А3 приведен на рисунке 2. Удивительно, но этот подход позволил собрать не только индивидуальные хромосомы человека, но даже разделить все хромосомы собаки [51]. Следует заметить, что задача идентификации всех хромосом собаки методами традиционной цитогенетики остается нерешенной и настоящее время. Предложенные варианты номенклатуры дифференциально окрашенных хромосом этого вида противоречивы и не эффективны.

Метод изоляции индивидуальных хромосом с помощью проточной цитофлуорометрии оказался наиболее эффективным и высокопроизводительным. До начала 90-х годов полученный таким образом материал использовали для получения фаговых ДНК-библиотек сортированных хромосом. Эта технология была достаточно дорогой и трудоемкой. Она также требовала большого количества исходного материала. Поэтому разработка эффективных методов ПЦР, позволяющих амплифицировать ДНК вне зависимости от первичной последовательности нуклкотидов имела огромное значение.

Идея технического решения использования для создания ДНК-проб индивидуальных хромосом полимеразной цепной реакции была очевидна. Выделенная ДНК индивидуальных хромосом должна быть переведена в форму небольших фрагментов от 200 до нескольких тысяч пар оснований (желательно около 1000 пар оснований), которые должены быть фланкированы универсальным праймером. Одним из наиболее эффективных для решения этой проблемы методов нужно признать предложенную в 1989 году LA-PCR (Linker-Adapted PCR) систему секвенснезависимой амплификации ДНК [29]. Следует иметь в виду, что термин LA PCR используется в настоящее время также для сокращения «Long and accurate PCR» (Takara Bio Inc, http://www.takara-bio.com/lapcr/title1.htm). ДНК обрабатывали мелкощепящей рестриктазой по RsaI-сайтам, расстояние между которыми в геноме человека в среднем составляет 493 пары оснований, к полученным фрагментам ДНК присоединяли синтетические олигонуклеотидные линкеры, содержащие последовательность гомологичную прямому и обратному праймерам М13/pUC. Полученный материал амплифицировали в стандартной ПЦР. Равномерное распределение RsaI сайтов в гене человека, как и других исследованных видов млекопитающих, позволило решить проблему полногеномной амплификации ДНК любых видов. Метод позволял получать ДНК-пробы даже из одной копии хромосомы, но требовал проводить выделение и первичную обработку ДНК в нанолитровых объемах, что предполагало использование микроманипуляционных процедур и делало метод крайне трудоемким [30; 42].

Идея секвенс-независимой амплификации ДНК была реализована в многочисленных исследованиях, в результате которых был предложен целый набор методов [48; 27]. Наиболее простой и достаточно эффективной оказалась амплификации ДНК с частично вырожденным праймером (Degenerate Oligonucleotide - primedPolymerase Chain Reaction - DOP-PCR) [44; 51]. И сегодня, спустя почти 20 лет DOP-PCR наиболее широко используется для создания районо- и хромосомоспецифичных ДНК-проб [51].

Особенностью DOP-PCR является ее проведение в два этапа. Низкая температура отжига (30⁰C) на первых циклах обеспечивает множественный отжиг праймера и генерацию фланкированных им фрагментов ДНК. Дальнейшее экспоненциальное увеличение числа копий этих фрагментов достигается в последующих высокотемпературных циклах при температуре отжига (56⁰С) (рис. 3). В этих условиях проведения DOP-PCR в амплификацию вовлекалась значительная часть исходной ДНК, достаточная для создания на основании полученного продукта качественных хромосомоспецифичных ДНК-проб.

Полученная в результате DOP-PCR ДНК представляет собой фрагменты размером от 200 до 1500 пар оснований, фланкированные соответствующим праймером. Метка вводится в дополнительных циклах ПЦР, проводимой с добавлением меченого дезоксинуклеотидтрифосфата, либо сразу, либо после дополнительных циклов реамплификации, позволяющей значительно увеличить количество конечного продукта за счет небольшого снижения его качества. После мечения ДНК обрабатывается ультразвуком, что обеспечивает оптимальный для проведения FISH размер фрагментов ДНК. Фрагментирование ДНК при производстве коммерческих ДНК-проб имеет еще одну цель. Она исключает возможность дополнительной амплификации ДНК пробы пользователем.

Выделение индивидуальных хромосом для генерации хромосомоспецифичных ДНК-проб может быть осуществлено и с помощью микроманипуляционной техники (методы микродиссекции метафазных хромосом, (рис. 4) [38; 42]. В дальнейшем также проводится амплификация ДНК выделенных индивидуальных хромосом и введение соответствующей метки. В настоящее время такие ДНК-пробы предлагает фирма METASystems GmbH (http://www.metasystems-international.com). В России для собственных нужд и проведения совместных исследований с другими организациями полный комплект всех хромосомоспецифичных ДНК-проб человека был получен в Институте цитологии и генетике СО РАН. Качество таких ДНК-проб при гибридизации с хромосомами человека практически не отличается от полученных из материала сортированных хромосом, но само их получение является более трудоемким и требующим более высокой квалификации исследователя. Т.е., получение хромосомоспецифичных ДНК-проб из сортированных хромосом оказалось более технологичным, что и определило их массовое производство этим способом.

В отличие от сортировки хромосом микроманипуляционная техника позволяет собирать материал не только индивидуальных хромосом, но и интересующих хромосомных районов. В настоящее время микродиссекция метафазных хромосом с последующей амплификацией ДНК в DOP-PCR представляет собой самый простой и быстрый способ получения районоспецифичных ДНК-библиотек. Пожалуй, единственной альтернативой получения ДНК-библиотек протяженных хромосомных районов является объединение искусственных хромосом дрожжей (YACов), содержащих ДНК интересующего района.

Отдельной проблемой является введение в ДНК элементов, которые позволяют визуализовать ее при микроскопии цитологического препарата. В первых экспериментах таким элементом являлся радиоактивный изотоп водорода (³Н). Препарат покрывали фотоэмульсией, и после, иногда, достаточно длительной экспозиции и обработки фотоэмульсии исследователь анализировал распределение на препарате зерен серебра. Использование радиоактивного мечения имело ряд недостатков, которые практически исключали использование гибридизации in situ в хромосомной диагностике. Замена радиоактивного изотопа водорода определенными химическими соединениями оказалось не только безопаснее, но также обеспечило более высокий уровень разрешения и открыло путь к одновременному использованию большого числа ДНК зондов, новым методам регистрации сигнала и обработки результатов in situ гибридизации. Последнее привело к появлению нового раздела цитогенетики – «количественной молекулярной цитогенетики», решению проблем которой уже было посвящено несколько крупных совещаний, таких как Euroconferences on Quantitative Molecular Cytogenetics.

Формально мечение ДНК для создания ДНК-пробы представляет собой любую модификацию ДНК, позволяющую детектировать ее на цитологическом препарате после гибридизации in situ. Принято подразделять мечение ДНК на прямое и непрямое. Прямое мечение предполагает введение в ДНК элементов, которые могут быть непосредственно визуализованы при последующей микроскопии. В случае люминесцентной или конфокальной микроскопии для мечения ДНК используют различные флуорохромы, например: флуоресцеинизотиоционат (FITC), родамин, аминометилкумарин AMCA, цианиновые красители (Cy3; Cy3.5; Cy5, Cy5.5, Cy7) и многие другие. При прямом мечении после завершения гибридизации перед проведением микроскопии требуется только отмывка оставшегося несвязанным меченого зонда. Список широко используемых флуорохромов и их спектральные характеристики можно найти на сайтах фирм, производящих микроскопическое оборудование, например на сайте CARL ZEISS (http://www.zeiss.de).

При непрямом способе мечения в качестве репортерных элементов могут быть использованы разные соединения. Наиболее широко используются биотин и дигоксигенин. Сегодня коммерчески доступен большой набор систем их детекции с помощью различных флуохромов. Очень широко, за исключением анализа тканей с высоким уровнем эндогенного биотина таких как, печень и почки, используется биотин, имеющий высокое сродство к авидину и стрептавидину (рис. 5), что позволяет использовать для его детекции их коньюгаты с различными флуорохромами. Иногда предпочтение отдается растительному алкалоиду дигоксигенину, детектируемому при помощи моноклональных антител. Он обеспечивает такую же чувствительность при детекции, как биотин, но дает более низкий уровень неспецифического связывания. Использование для непрямого мечения различных репортерных элементов также позволяет проводить FISH одновременно с несколькими ДНК пробами. Непрямой вариант мечения ДНК пробы обычно позволяет добиться уровня сигнала, в несколько раз превышающего сигнал при использовании прямомеченой ДНК-пробы при использовании одинаковых флуорохромов. Это объясняется присутствием на молекуле антитела 3-4-х молекул флуорохрома. Кроме того, в некоторых системах детекции существует возможность каскадного усиления сигнала. Например, сигнал может быть усилен последовательными обработками препарата: авидин, коньюгированный с флуорохромом, биотинилированные антитела, специфичные к авидину и авидин, коньюгированный с флуорохромом. При необходимости этап усиления сигнала может быть повторен. К сожалению, одновременно с интенсивностью сигнала растет уровень фона, что не позволяет проводить бесконечные циклы усиления. С совершенствованием микроскопической техники и техники регистрации флуоресцентного сигнала острота проблемы регистрации слабого сигнала значительно уменьшилась. Охлаждаемые CCD -камеры позволяют накапливать сигнал в течение десятков минут и надежно регистрировать очень слабую флуоресценцию. Кроме того, постоянно увеличивается число новых высокоэффективных флуорохромов. Этим обусловлена тенденция все более широкого использования прямо меченых ДНК-проб, но и сегодня при проведении FISH с одним или с двумя ДНК пробами часто используется старый, но надежный и более дешевый непрямой метод мечения ДНК.

Общие принципы молекулярно-цитогенетического анализа.

Основной задачей при проведении хромосомной диагностики является выявление хромосомных аномалий и их точное описание. Современные методы молекулярной цитогенетики позволяют сделать это двумя принципиально различными способами:

• Визуализация на цитологических препаратах соответствующих последовательностей ДНК;
• Создание ДНК-проб из анализируемого объекта для последующего выяснения вопроса, какие последовательности ДНК и в какой дозе они присутствуют в анализируемых хромосомах или клетках.

Гибридизация нуклеиновых кислот является основной при проведении практически любой молекулярно-цитогенетической диагностики. Существующие технологии позволяют проводить секвенирование индивидуальных геномов. Но принципиальные возможности и практическая диагностика значительно отличаются друг от друга. В практической медицине важно получить быстрый и правильный ответ на поставленный вопрос. В ряде случаев поставленный вопрос может быть предельно конкретным. Исходя из имеющихся данных, требуется определить, есть ли в клетках пациента определенная хромосомная перестройка. В современной молекулярной цитогенетической диагностике существует множество подобных случаев.

Поиск по сайту: