Визуализация специфичных хромосомных локусов

Примером молекулярно-цитогенетической диагностики, базирующейся навизуализация специфичных хромосомных локусов, может служить выявление делеций, ассоциированных с микроделеционными синдромами. Предпосылкой для проведения такой диагностики обычно является выявление у пациента фенотипа, соответствующего одному из микроделеционных синдромов. Размер делеции слишком мал для ее надежной регистрации рутинными методами хромосомного анализа, но проведение FISH может дать однозначный ответ на вопрос: присутствует ли в хромосоме последовательность ДНК, в норме находящаяся в районе предполагаемой делеции, либо она утеряна. Для проведения такой FISH требуется специальная ДНК-проба: меченая ДНК из района делеции. Так как такие ДНК-пробы предназначены для детекции определенных локусов хромосомы, для их обозначения обычно используют термин - идентификатор специфичных хромосомных локусов (Locus Specific Identifier – LSI). В настоящее время имеется широкий выбор коммерчески доступных ДНК-проб для проведения диагностики большинства микроделеционных синдромов. Достаточно заглянуть на сайт Abbott Molecular (http://international.abbottmolecular.com), чтобы ознакомиться с огромным списком LSI. В качестве примера использования LSI можно привести детекцию микроделеций в районе 15q11→q13, с которыми связаны синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана (рис. 6.). В настоящее время существует набор клонированных фрагментов ДНК (локусы D15S10, D15S15, SNRPN, GABRB3), на базе которых созданы ДНК-пробы для определения таких делеций. Так как известна их локализация в хромосоме (рис. 6), FISH таких LSI позволяет уточнять границы делеций.

FISH LSI с метафазными хромосомами и интерфазными ядрами широко используется в хромосомной диагностике и при онкологических заболеваниях. Например, при остром миелоидном лейкозе типа М2 большое значение имеет выявление транслокации t(8;21)(q22;q22). На рисунке 7 представлены схемы хромосом и рекомендуемые для проведения диагностики LSI. В норме ген AML1 (RUNX1) локализован в районе 21q22, ген ETO (CBFA2T1) в районе 8q22. В случае транслокации t(8;21)(q22;q22) происходит формирование химерного гена AML1/ETO. Таким образом, и на хромосоме der(8)t(8;21), и на хромосоме der(21)t(8;21) в районе транслокации присутствуют последовательности ДНК, гомологичные части ДНК гена AML1, и ДНК гена ETO. Проведение двухцветной FISH c LSI AML1 и LSI ETO дает одноцветные сигналы на нормальных хромосомах 8 и 21 и двухцветные сигналы на их дериватах (рис. 7). Следует заметить, что число и тип сигналов при проведении FISH не зависит от стадии клеточного цикла, что позволяет выявлять t(8;21)(q22;q22) непосредственно в интерфазных ядрах. Такие возможности проведения диагностики, отрывающиеся при использовании FISH, особенно важны в тех случаях, когда в образце практически отсутствуют делящиеся клетки, например, после проведения курса химиотерапии.

Аналогичный подход используется для выявления большинства диагностически значимых транслокаций и инверсий. К ним, несомненно, относится и филадельфийская хромосома - t(9; 22)(q34; q11), и t(6;9)(p23;q34.3), t(15;17)(q22;q21.1), t(16;16)(p13;q22) или inv(16)(p13q22). Общее направление развития диагностики при гемопоэтических неоплазиях наглядно демонстрирует эволюция методов выявления inv(16)(p13q22).

Идентификация хромосомных перестроек с точками разрывов в 16р13 и 16q22 позволяет выделять определенную группу больных среди пациентов с острой миелоидной лейкемией. Хромосомные аберрации с такими точками разрывов встречаются в виде inv(16)(p13;q22), реже - t(16;16)(p13;q22). Инверсия в хромосоме 16 часто связана с FAB М4_ЕО подтипом острой миелоидной лейкемии. Она также наблюдается при типе М4 без эозинофилии и в М2 подтипе. Для больных с острой миелоидной лейкемией и inv(16) только эта хромосомная аномалия имеет прогностическое значение. Следует заметить, что острая миелоидная лейкемия c inv(16) представляет собой один из самых благоприятных ее вариантов, при котором число пациентов с ремиссией более 5 лет достигает почти 50%. В то же время, среди пациентов с острой миелоидной лейкемией и inv(16) наблюдается более высокая частота рецидивов, которая, однако, может быть уменьшена при терапии более высокими, чем стандартные, дозами Ara-С.

Таким образом, надежная идентификация inv(16) имеет не только прогностическое значение, но также важна для определения стратегии химиотерапии. Использование GTG-дифференциального окрашивания хромосом оставляло открытым вопрос о ее присутствии в значительном числе случаев. Для решения этой проблемы были получены 16р и 16q специфичные ДНК-пробы. Так как перицентрическая инверсия хромосомы 16 приводит к перемещению материала из одного плеча в другое, и, соответственно, к разрыву на хромосоме в норме единого непрерывного сигнала (рис. 8) или чередованию цветов при постановке двухцветной FISH [9], ее детекция стала простой и надежной даже на хромосомных препаратах очень низкого качества. Следующий шаг стал возможным, благодаря точной локализации точек разрыва при этих хромосомных перестройках, и созданию соответствующего комплекта ДНК-проб (LSI CBFB). LSI CBFB состоит из двух клонированных фрагментов ДНК, меченых разными флуорохромами (рис. 9). Один из них расположен проксимальнее, другой – терминальнее точки разрыва, на расстоянии 50 kb один от другого. На нормальной метафазной хромосоме и в интерфазном ядре сигналы этих ДНК-проб имеют общую локализацию, тогда как на хромосоме inv(16)(p13q22) или хромосоме t(16;16)(p13;q22) они расположены далеко друг от друга (рис. 9).

Особое положение среди хромосомных перестроек, наиболее типичных при гематологических нарушениях, занимают перестройки, затрагивающие ген MLL, локализованный в районе 11q23. Выявлено более 30 вариантов транслокаций в этом районе. Наиболее часто встречаются следующие хромосомные перестройки: t(4;11)(q21;q23), t(9;11)(p22;q23) и t(11;19)(q23;p13). Более того, примерно в 25% транслокаций, вовлекающих район 11q23, имеют место делеции с точками разрывов, одна из которых расположена в локусе MLL, а вторая – более дистально. В связи с этим для анализа подобных перестроек оказалось наиболее эффективным является использование комбинации ДНК-проб из этого района, меченных разными флуорохромами [16]. В интерфазных ядрах клеток, несущих нормальные хромосомы 11, FISH с этими ДНК-пробами дает совмещенные сигналы. В клетке, несущей t(11;?)(q23;?), выявляется один сайт совмещенных сигналов (нормальная хромосома) и два сигнала разного цвета, отстоящих друг от друга на некотором расстоянии. В случае делеции части MLL выявляется один двухцветный и один одноцветный сигнал. Такой подход позволяет выяснить есть ли перестройка, затрагивающая район 11q23. Причем для этого достаточно рассмотрения результатов FISH с интерфазными ядрами. В интерфазных ядрах с одной нормальной и одной перестроенной хромосомой выявляется один совмещенный и два раздельных сигнала в случае транслокации, либо один совмещенный и один одноцветный сигнал в случае делеции.

Анализ гемопоэтических неоплазий показал, что их классификация позволяет выделять не отдельные заболевания, а скорее группы сходных заболеваний, которые, тем не менее, могут отличаться по своей этиологии, механизму лейкемиегенеза и прогнозу развития. В качестве примера ниже рассмотрим острые лейкемии. Они могут быть классифицированы в соответствии с их морфологическими, иммунофенотипическими и цитогенетическими характеристиками. Эти три метода классификации были объединены в единую MIC классификацию (morphological, immunological, cytogenetic), включающую в себя FAB (French-Amercan-British) морфологическую классификацию, которая разделяет острые миелолейкемии на семь или восемь групп, а острые лимфолейкемии на три группы. MIC классификация обеспечивает более детальное подразделение острых лейкемий и позволяет введение новых групп при проведении дальнейших исследований [5]. Для классификации лимфобластных лейкемий огромное значение играет проведение иммунологического и цитогенетического анализа. При классификации острых миелоидных лейкемий большое значение имеют морфологические и кариотипические исследования. Определение иммунофенотипа существенно только для опознавания острой мегакариобластной лейкемии М7 и М0 типа острой миелоидной лейкемии. Определение хромосомных аномалий может служить как для подтверждения анализа, так и для его постановки. Примером последнего служит диагностика гипогранулярного варианта М3 типа острой миелоидной лейкемии при выявлении t(15;17).

Цитогенетический анализ позволяет определять случаи клональной эволюции связанные с ухудшением прогноза, например обнаружение кариотипических аномалий в случаях миелодисплазивного синдрома. Об ухудшение прогноза свидетельствует и выявление новых хромосомных аномалий при хронической гранулоцитной лейкемии. Во время бластного криза значительная часть пациентов имеют вторичные кариотипические аномалии. Рецидивы миелобластной лейкемии часто связаны с появлением клеток с новыми кариотипическими аномалиями. Интересно отметить различия дополнительных кариотипических нарушений, имеющих место при лимфобластной и миелобластной трансформациях, что, вероятно, является следствием реализации различных генетических механизмов клеточной трансформации.

Описанный подход к анализу хромосомных патологий методом гибридизации in situ специально разработанных для этих целей ДНК-проб с интерфазными ядрами применим и при проведении диагностики в случае солидных опухолей.

Поиск по сайту: