Многоцветная FISH

FISH отдельных хромосомоспецифичных ДНК-проб эффективен при проверке уже возникших подозрений. Для полного кариотипирования требуется одновременное проведение FISH со всеми хромосомами человека. Т.е., необходимо одновременно провести гибридизацию с 24-мя ДНК-пробами (22 пары аутосом, половые хромосомы X и Y) и иметь возможность их одновременной детекции. К сожалению, в настоящее время невозможно подобрать комплект из 24-х флуорохромов, неперекрывающихся по эмиссионному спектру. Решение проблемы было найдено благодаря применению комбинаторного мечения ДНК. Его принцип заключается в мечении хромосомоспецифичной ДНК-пробы не одним, а набором флуорохромов. Использование «n» флуорохромов обеспечивает 2ⁿ-1 уникальных вариантов мечения ДНК-проб. Т.е., уже пять флуорохромов обеспечивает 31 вариант мечения, что с избытков покрывает все потребности одновременного мечения хромосомы человека. В 1996 году при разработке 24-цветной FISH было реализовано два технических решения по анализу результатов гибридизации in situ комбинаторно меченых ДНК-проб. Одно из них базировалось на последовательной регистрации сигналов отдельных используемых флуорохромов с последующей компьютерной обработкой полученной информации (multiplex FISH - M-FISH) [43]. Альтернативное решение было найдено благодаря развитию техники спектрального анализа, которая позволяла получать спектральную кривую для каждой точки анализируемого микроскопического изображения (спектральное кариотипирование – SKY). Анализ полученных кривых позволял определять, какие флуорохромы присутствовали в каждой точке [40]. Рассмотрим более подробно эти методы.

Несмотря на то, что в современной терминологии постоянно используются слова с корнем «цвет», при регистрации микроскопических изображений, полученных в результате проведения M-FISH, используются монохромные (черно-белые) камеры. Спектральная характеристика регистрируемого сигнала определяется комплектом фильтров, и использование цветной камеры может только значительно снизить чувствительность системы регистрации сигнала. Т.е., на практике проводится регистрация сигнала в разных каналах, и основной задачей организации микроскопии является наряду с обеспечением необходимого уровня чувствительности исключение регистрации сигналов флуорохромов, посторонних для данного канала. Для удобства и простоты представления и восприятия результатов регистрации сигналов в соответствующих каналах при их одновременном выведении на монитор компьютера или твердый носитель (печать на бумаге) используются псевдоцвета. Т.е., сигналу каждого канала присваивается определенный псевдоцвет. Псевдоцвет может не иметь ничего общего с реальным цветом флуорохрома. Например, в статьях часто можно встретить окраску хромосом красителем DAPI, представленную красным цветом. Это обусловлено тем, что при печати на бумаге комбинация красного и зеленого позволяет проще показать больше деталей, чем комбинация синего и зеленого.

Благодаря большим успехам в разработке новых флуорофоров в настоящее время возможно собрать несколько вариантом для комбинационного мечения. Один из таких вариантов для M-FISH приведен на рисунке 10. Использовали пять флуорохромов для мечения хромосомоспецифичных ДНК-проб (FITC, Spectrum Orange, TexRed, Cy5, DEAC) и шестой флуорохром (DAPI) для общей окраски хромосом. Регистрация сигналов в шести каналах при проведении M-FISH показана на рисунке 11. Дальнейшая компьютерная обработка, проведенная с помощью специализированного программного обеспечения, позволяет сформировать новые типы псевдоцветов, соответствующих конкретным хромосомам. Например, точке, где одновременно представлены сигналы DAPI, FITC и Cy5, присваивается псевдоцвет хромосомы 6. При выявлении дополнительно к ним сигнала флуорохрома DEAC, - псевдоцвет хромосомы 16 (рис. 10). Таким образом, формирование 24-х псевдоцветов позволит идентифицировать материал всех хромосом человека.

Такой же принцип формирования псевдоцветов и идентификации материала хромосом человека используется при спектральном кариотипировании. Эти методы отличают технические решения, использующиеся при идентификации флуорохромов, присутствующих в каждой из точек препарата. При спектральном кариотипировании для каждой точки микроизображения снимается полная спектральная характеристика. Процесс осуществляется с помощью приборной базы «Spectral Imaging», которая хорошо зарекомендовала себя ранее в промышленности и в разнообразных исследованиях, требующих точного описания спектральных характеристик объекта. Она позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости от того, связано ли это с флуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Такой способ регистрации сигнала оказался менее чувствителен к вариациям интенсивности сигналов и позволил достичь лучшего отношения сигнал / шум. При спектральном кариотипировании хромосом человека также, как при M-FISH, для создания ДНК-проб используют пять флуорохромов: один работает в зеленой области спектра, два - в красной и два - в инфракрасной. Возбуждение и эмиссия всех этих флуорохромов происходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать последовательной смены фильтров, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними таких проблем, как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и использование сегментационных масок. В одном акте экспозиции полная спектральная характеристика испускаемого света записывается одновременно для каждой точки изображения. На основании анализа спектральных кривых определяется наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов. Следующим шагом является процедура классификации, выполняемая с помощью специального программного обеспечения, которое позволяет определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала нормальных хромосом, а также дериватов хромосом, возникших в результате разнообразных перестроек. Большим достоинством метода SKY является то, что параллельно анализу спектральных характеристик регистрируется окрашивание флуорохромом DAPI, которое после обработки специальной программой улучшения изображения достигает по своему качеству уровня дифференциальной исчерченности хромосом, получаемой при GTG-дифференциальном окрашивании. Возможность параллельного анализа результатов SKY и качественной дифференциальной окраски позволяет более точно определять точки разрывов при хромосомных перестройках. К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что расширяет список веществ, пригодных к использованию в SKY.

Несмотря на огромные возможности 24-х цветной FISH ее применение имеет свои ограничения. Естественно, все ограничения использования отдельных хромосомоспецифичных ДНК-проб распространяются и на их комплексное использование. Это касается упоминавшихся ранее инверсий, небольших делеций и дупликаций. К сожалению, существуют также дополнительные проблемы, связанные с комбинаторным мечением и одновременной гибридизацией большого числа ДНК-проб. Так как, по крайней мере, для части хромосом, ДНК-пробы которых мечены двумя или тремя флуорохромами, при проведении 24-х цветной FISH имеет место конкуренция за места гибридизации фрагментов ДНК, конъюгированных с разными флуорохромами. Это, естественно, приводит к падению интенсивности сигнала отдельных флуорохромов. Феномен уменьшения чувствительности 24-х цветной FISH при выявлении небольших районов хромосомы относительно FISH с хромосомоспецифичными пробами без использования комбинаторного мечения хорошо известен цитогенетикам. Другая проблема связана с особенностями приготовления препаратов метафазных хромосом. В ходе их приготовления ДНК хромосомного района распластывается во всех направлениях, что обуславливает перемешивание ДНК разных районом хромосом, примыкающих к точке разрыва/соединения хромосом. В связи с этим в районе контакта после проведения 24-х цветной FISH присутствуют флуорохромы, которые были использованы для мечения обоих хромосом. При некоторых транслокациях этот феномен может приводить проблемам в интерпретации полученных результатов. Рассмотрим некоторые из них, возникающие при варианте мечения, представленном на рисунке 10:

1. Транслокация хромосом 1 и 2. При транслокации возникает район, по сигналу флуорохромов соответствующий материалу хромосомы 7. Отличить такую имитацию от реальной инсерции небольшого района хромосомы 7 достаточно сложно. В случае t(1;2;7) произойдет лишь небольшое расширение района, окрашиваемого псевдоцветом, соответствующим хромосоме 7.

2. Инсерция небольшого района хромосомы 1 в хромосому 7. Инсерция размером менее 10 млн. пар оснований не выявляется, так как материал инсерции будет «прикрыт» материалом хромосомы 7.

3. Транслокация небольшого терминального района хромосомы 1 в хромосому 7. Транслокация размером менее 10 млн. пар оснований не выявляется по тем же причинам, что и рассмотренная выше инсерция.

4. При эффективной супрессии гибридизации повторенных последовательностей не определяется происхождение С-позитивных районов хромосом.

Проведение сравнения эффективности использования M-FISH и SKY сталкивается с рядом проблем. Качество результатов, полученных с помощью этих технологий, в значительной степени зависят от конкретной комплектации используемого оборудования и качества ДНК-проб. При этом приходится признать, что недостатки или проблемы использования каждой из технологий являются продолжением их достоинств и преимуществ. Например, полная автоматизация классификации псевдоцветов при использовании SKY позволяет исключить человеческий фактор, но в случае сложных хромосомных перестроек, включающих небольшие хромосомные районы, оказывается очень сложно или даже невозможно провести настройку системы для решения конкретной проблемы. При M-FISH исследователь имеет в своем распоряжении огромные возможности настройки классификатора псевдоцветов, задавая пороговые значения сигнала или в «ручную» анализируя имиджи, полученные при регистрации отдельных флуорохромов. Это позволяет провести более детальный анализ конкретной перестроенной хромосомы и прийти к более обоснованному заключению. Однако, в этом случае существенно возрастает ответственность исследователя, и огромную роль начинают играть его индивидуальные качества. Собственный опыт диагностики сложных хромосомных перестроек с использованием M-FISH и SKY [19] может быть обобщен следующим образом: SKY более удобен при проведении стандартной диагностики, но M-FISH предоставляет больше возможностей для анализа аномальных хромосом, в состав которых входят небольшие (менее 10 МВ) районы разных хромосом.

Рассматривания варианты многоцветной FISH необходимо отметить существующую сегодня возможность проведения 42-х цветной FISH, которая позволяет идентифицировать материал всех плеч хромосом человека за исключение коротких плечей актоцентрический хромосом и Y-хромосомы []24]. Для ее проведения требуется использование 18-ти дополнительных ДНК-проб, специфичных плечам хромосом, шести флуорохромов для комбинаторного мечения 42-х ДНК проб и микроскопическое оборудование позволяющее раздельно регистрировать сигналы семи флуорохромов.

Поиск по сайту: