Обратная цитогенетика

Альтернативно прямой молекулярно-цитогенетической диагностике, основанной на гибридизации стандартных ДНК-проб с хромосомами или интерфазными ядрами клеток пациента, может быть использовано создание оригинальной ДНК-пробы из интересующего образца с последующим ее изучением. Такая ДНК-проба может представлять собой как меченую геномную ДНК интересующих исследователя клеток (раковые клетки), так и ДНК анализируемой аномальной хромосомы. Если геномная ДНК используется в сравнительной геномной гибридизации, чему будет посвящена отдельная глава, то FISH ДНК-пробы с нормальными хромосомами или со специальными чипами позволит определить нарушения баланса хромосомных районов. FISH ДНК-пробы аномальной хромосомы с метафазными хромосомами пациента и здорового донора позволит просто и надежно определить состав аномальной хромосомы. Теоретически создание ДНК-пробы аномальной хромосомы возможно разными способами: микроманипуляционный сбор одной или нескольких копий аномальной хромосомы; получение культуры клеток и последующий сортинг метафазных хромосом; получение гибридов соматических клеток, содержащих только одну хромосому человека, которая и интересует исследователя. В практической диагностике используется только первый из них. Он позволяет сделать заключение о составе аномальной хромосомы в течение трех дней. В первый день проводится микроманипуляционный сбор материала, его обработка и DOP-PCR. На следующий день проводится мечение продукта DOP-PCR и постановка FISH с метафазными хромосомами пациента и здорового донора. Следующим утром проводится отмывка препаратов и детекция меченой ДНК, если использовалось непрямое мечение. В этот же день проводится микроскопический анализ, по результатам которого делается окончательное заключение. Описанный метод имеет ряд несомненных достоинств. Он позволяет определять не только происхождение хромосомный районов, но также позволяет дать их достаточно точное описание. Опыт его использования показал, что он имеет более высокую чувствительность при выявлении небольших транслокаций и инсерций при анализе сложных хромосомных перестроек [19]. К сожалению, есть ряд проблем, с которыми исследователь встречается при его применении. Основным условием его успешного использования является необходимость идентификации интересующей хромосомы при проведении микроскопического анализа. В связи с этим обычно проводится микродиссекция GTG-окрашенных хромосом. Рассмотрим один из типичных примеров. В результате проведения стандартного хромосомного анализа пациента в медико-генетической консультации в г. Новосибирске была выявлена аномальная хромосома, описанная 3р+ [1]. Создание ДНК-пробы из 3р+ хромосомы с последующей ее гибридизации с хромосомами пациента и здорового донора (рис. 14) позволило определить ее состав и описать кариотип пациента как mos 46,XY,der(3)t(3;10)(3p25;q24.3)[69]/46,XY[31].

Выявленный мозаицизм и отсутствие каких-либо хромосомных патологий у родителей носителя «3р+» позволяют с уверенностью говорить о возникновении данной хромосомной перестройки de novo. Присутствие der(3)t(3;10)(3p25;q24.3) более, чем в двух третях клеток приводит к мозаицизму по частичной моносомии 3р (дистальная часть района 3р25) и частичной трисомии 10q (район 10q24.3®qter). Насколько нам известно, приведенный в настоящей статье случай является первым примером частичной трисомии 10q и частичной моносомии 3р, возникшими de novo. Механизм формирования данной хромосомной перестройки неясен. Мозаицизм по присутствию аномальной хромосомы, высокий процент клеток клона с хромосомой 3р+, значительные отклонения в развитии ребенка указывают на то, что реорганизация хромосом имела место на ранних этапах пренатального развития. В качестве одного из возможных предположений, объясняющих появление аномального клона, можно предложить транслокацию хромосомного материла 3-ей и 10-ой хромосом с последующим нарушением расхождения хромосом в митозе, приведшим к потере der(10) и унипарентной родительской дисомии нормальной хромосомы 10. Следует отметить, что отсутствие у пациента характерных для частичной моносомии 3р дефектов сердечнососудистой системы указывает на локализацию точки разрыва дистальнее локусов D3S1585 и D3S1263 в коротком плече 3-ей хромосомы [11; 25].

Проведение подобного анализа значительно осложняется в случае, если дифференциальная окраска хромосом не позволяет надежно определить аномальную хромосому. Одним из примеров такой диагностики является проведенный нами анализ аномальной хромосомы 6. В результате стандартной процедуры кариотипирования в было высказано предположение, что приблизительно в 30% клеток один из гомологов хромосомы 6 имеет аномалию длинного плеча. Для постановки окончательного анализа было собрано три копии аномальной хромосомы, получена ДНК-проба и проведена FISH с метафазными хромосомами, по результатам которого аномальная хромосома была описана как del(6)(q23.1→27) (рис. 15). Неожиданным результатом проведения такого анализа оказалось наличие хромосомы del(6) во всех клетках пациента. Т.е., приблизительно в 70% клеток при анализе GTG-дифференциально окрашенных хромосом аномалия хромосомы 6 оставалась незамеченной [38].

Для идентификации аномальной хромосом с целью ее последующей микродиссекции может быть использовано предварительное проведение FISH соответствующей ДНК-пробы [12]. В качестве альтернативного варианта создания ДНК-проб могут быть получены отдельные ДНК-пробы из гомологичных хромосом, выделенных из одной и той же метафазной пластинки.

В ряде случаев создание ДНК-проб аномальных хромосом методом микродиссекции с последующей DOP-PCR может оказаться решением в казалось бы безысходной ситуации почти полного отсутствия метафаз на цитологическом препарате. К сожалению, с такой проблемой периодически сталкивается большинство цитогенетических лабораторий. Примером могут служить хромосомная диагностика после проведения химиотерапии, отсутствие нормального роста клеток при пренатальной диагностике и т.д.. Одним из таких случаев явилось проведение цитогенетического скрининга у проживающих в удаленных от транспортных магистралей районах севера Сибири. Транспортировка образцов крови заняла более трех дней, что обусловило крайне низкое качество хромосомных препаратов у части пациентов (две три метафазы очень низкого качества на препарат). Тем не менее, специалистам Института генетики человека Томского Научного Центра СО РАМН (зав. лабораторией цитогенетики проф. С.А. Назаренко) удалось обнаружить у одного из пациентов три аномальные хромосомы. Для их описания в ИЦиГ СО РАН методом микродиссекции и последующей DOP-PCR были получены ДНК-пробы аномальных хромосом и проведена FISH со стандартными метафазными хромосомами человека. В результате было показано присутствие у пациента сбалансированной транслокации t(6;15) (рис. 16а) и кольцевой хромосомы r(14) (рис. 16б).

Поиск по сайту: