Метод виявлення РНК та ДНК фарбуванням метиловим зеленим - піроніном за Унна-Паппенгеймом з контролем рібонуклеазою (реакція Браше)

Сумарне забарвлення НК в зрізах хромовим крап-лаком галлоціаніну (за Ейнарсоном)

Реактиви:

• Галлоціанін................. 0,15 г

• Хромовий галун............. 5,0 г

• Вода..................... 100 мл

q 5 г хромового галуну розчиняють в 100 мл води і додають 0,15 г галлоціаніна. Суміш струшують, нагрівають до кипіння. Кип'ятять 5 хв.

Охолоджують, фільтрують і доводять об'єм водою через фільтр до 100 мл.

Барвник повинен мати рН 1,6.

q Принцип: Галлоціанін з хромовим галуном дає сполуку краплак-катіон, який з фосфатними групами нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) утворює солі темно-синього кольору.

Щоб виключити вплив білків на забарвлення, фарбування нуклеїнових кислот потрібно вести при рН 1,5 - 1,6.

q Фарбування триває до 2 діб, при кімнатній температурі.

Промити у проточній воді, сполоснути у дистильованій воді,

Заключити у відповідне середовище

Виявлення ДНК. Реакція Фьольгена.

• Заморожені зрізи, мазки, відбитки; Всі фіксатори, крім Буена

• Принцип: м’який кислотний гідроліз ДНК (1 н НСl при 60^о) з утворенням альдегідних груп, які виявляються реактивом Шиффа.

• Реактиви.

• 1.Реактив Шиффа.

• 2. 1 н. розчин соляної кислоти.

• 3. Сірчиста вода.

• 4. 0,1% спиртовий розчин барвника світлий-зелений.

Сірчиста вода. До 200 мл дистильованої води додають 10 мл 10% розчину гідросульфіту натрію (Na₂SO₃) і 10 мл 1 н. розчину хлористоводородної кислоти. Сірчиста вода готується перед використанням і повинна мати характерний запах діоксиду сірки (сірчистого ангідриду, SO₂).

Хід реакції.

1.Препарат доводять до води.

2. Ополіскують в розчині 1н. HCI.

3. Проводять гідроліз в 1н. HCI при 60^оС - 8-12 хв.

4. Промивають дистильованою водою.

5. Забарвлюють реактивом Шиффа протягом 0.5-1 години (в темряві).

6. Промивають в трьох змінах сірчистої води по 3 хв.

7. Промивають в трьох змінах дистильованої води по 3 хв.

8. При необхідності дофарбовують світлим-зеленим (лихтгрюн).

9. Промивають в дистильованій воді.

10 Заключають.

Метод виявлення РНК та ДНК фарбуванням метиловим зеленим - піроніном за Унна-Паппенгеймом з контролем рібонуклеазою (реакція Браше).

Використовувати метод забарвлення Унни-Паппенгейма для виявлення РНК було запропоновано Браше. При цьому з пари сусідніх зрізів один обробляють рібонуклеазою для руйнування РНК. Потім обидва зрізи забарвлюють метиловим зеленим-піроніном і порівнюють. Матеріал, що забарлюється в червоний колір піроніном і зникаює на зрізах, оброблених рибонуклеазою, являє собою РНК. ДНК ядра фарбується метиловим зеленим в зелений колір. У багатьох випадках, наприклад при роботі з нервовою тканиною, обробки рібонуклеазою не потрібно, так як в ній немає інших, крім РНК, компонентів, які б забарвлювалися піроніном.

Найкращим фіксатором для реакції Браше є рідина Карнуа.

Приготування розчинів.

1. Метиловий зелений необхідно очистити від домішків метилового фіолетового. Для цього порошок метилового зеленого заливають хлороформом (10-15 мл хлороформу на 0,1 г барвника), ретельно збовтують і залишають на 2-3 год. Потім знову збовтують і фільтрують. Метиловий фіолетовий переходить у хлороформ. Порошок барвника на фільтрі ще кілька разів промивають хлороформом. Висушений порошок використовують для приготування розчину барвника.

2. Приготування фарбую чого розчину:

0,5 г метилового зеленого розчиняють в 100 мл 0,1 М розчину ацетатного буфера з рН 4,4. До цього розчину додають 0,2 г піроніну.

Можна використовувати й інший пропис:

метилового зеленого 0,15 г,

піроніну 0,25 г,

спирту 96 ° 2,5 мл,

гліцерину 20 мл,

0,5% водного розчину карболової кислоти (фенол) 100 мл.

Методика фарбування:

1) Депарафіновані зрізи з дистильованої води переносять в метиловий зелений- піронін на 1-2 год і більше (до 1 доби);

2) зрізи швидко споліскують водою, швидко обсушують фільтрувальним папером;

3) заключають у відповідне середовище;

Результат: ядра синювато-зелені, РНК ядерець і цитоплазми рожевого кольору.

Ферментативний контроль (при необхідності). Зріз обробляють в розчині рибонуклеази в концентрації 0,1-0,5 мг / мл в термостаті при 37 ° С протягом 4-8 год. Ділянки клітини, що містять РНК, після такої обробки піроніном не фарбуються. Реакція на РНК по Браше не підходить для кількісного аналізу, з цією метою значно надійнішим є виявлення нуклеїнових кислот за допомогою галлоціаніна і хромового галуну за Ейнарсоном.

Поиск по сайту: