Определение активности ацетилхолинэстеразы в сыворотке крови

Принцип метода. Холинэстераза катализирует реакцию гидролиза ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В результате изменяется рН буферного раствора, поэтому мерой активности фермента может быть изменение рН инкубационной среды.

Реактивы, исследуемый материал: 1) 3,5% ацетилхолин; 2) раствор мединала для калибровочной кривой (10,3 г мединала растворяют в 500 мл воды); 3) 0,1 М НС1; 4) веронал-мединаловый буфер, рН 8,4 (2,06 г мединала растворяют в 100 мл воды и 82,3 мл этого раствора смешивают с 17,7 мл 0,1 М раствора НС1); 5) 0,02% феноловый красный на 0,025 М НС1; 6) сыворотка крови.

Ход работы. В одну пробирку вносят 1 мл буферного раствора, 0,5 мл раствора ацетилхолина и 0,1 мл сыворотки, в другую – 1 мл буферного раствора, 0,5 мл воды, 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки инкубируют 60 мин при 37°С. За 2-3 мин до окончания инкубации в обе пробирки добавляют по 3,5 мл воды и 0,1 мл раствора фенолового красного. Определяют оптическую плотность опытной и контрольной проб в кювете толщиной 10 мм при длине волны 536 нм (зелёный светофильтр).

Калибровочная кривая. Согласно таблице готовят ряд буферных растворов:

К 10 мл каждого буферного раствора прибавляют по 0,1 мл раствора фенолового красного и определяют величины оптической плотности (как в опытных пробах). При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают найденные величины оптической плотности, а по оси абсцисс — соответствующие значения рН раствора.

Активность ацетилхолинэстеразы оценивают согласно калибровке по величине изменения рН опытной пробы по сравнению с контрольной, а также в миллимолях уксусной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации. Реакция может быть остановлена добавлением прозерина.

Ферменты синтеза ацетилхолина и норадреналина находятся в постсинаптических окончаниях соответствующих нервных волокон, фермент распада ацетилхолина (холинэстераза) — на поверхности постсинаптической мембраны. Ацетилхолин в процессе инактивации распадается на составные части (ацетат и холин) – те самые, из которых происходит его синтез. Норадреналин не превращается в исходный тирозин, а подвергается модификации, следовательно, продукты его инактивации повторно не используются.

Ацетилхолин взаимодействует с рецепторами, а также с холинэстеразой; прозерин конкурирует за связывание ацетилхолина лишь с холинэстеразой. Поскольку прозерин — конкурентный ингибитор, то при повышении концентрации ацетилхолина действие его на холинэстеразу уменьшается. Фармакологический эффект прозерина (усиление парасимпатических реакций) при введении ацетилхолина не уменьшится. Сам прозерин вызывает накопление в синапсе ацетилхолина, который беспрепятственно действует на рецепторы. Дополнительное введение ацетилхолина, возможно, высвободит холинэстеразу, но не уменьшит концентрацию ацетилхолина и возбуждение рецепторов.

Поиск по сайту: