Принцип работы и устройство микроскопа

С точки зрения современной физики световой микроскоп представляет собой достаточно сложный прибор - частично когерентный оптический процессор, для описания работы которого используется диффракционная теория света. Оптика микроскопа практически мгновенно выполняет преобразования световых волн, проходящих через полупрозрачную клетку, в результате чего формируется ее изображение, доступное для наблюдения глазом человека.

Самые простые световые волны генерируются лазерами. Эти волны отличаются когерентностью (все волны идут как одна, без смещения) и монохроматичностью (все волны одной длины, поэтому имеют один цвет). Когерентная и монохроматичная световая волна описывается уравнением:

,

где A - амплитуда волны, T - ее период, t - время, x - расстояние, v - скорость света в данной среде.

Если вместо периода волны T ввести пространственную частоту u = 1/T и принять, что A = 1, t = 0, а скорость волны не меняется (среда однородная), то мы получим более простую форму уравнения световой волны:

Следует отметить, что второе уравнение носит более абстрактный характер, в частности, в нем введена безразмерная пространственная частота u вместо частоты колебаний электромагнитной волны, выражаемой в Гц.

Встретившись с круглым отверстием небольшого диаметра f(x), такая световая волна будет огибать его края и создавать диффракционную картину F(u), состоящую из центрального максимума нулевого порядка, который окружен концентрическими максимумами первого, второго и последующих порядков с убыванием интенсивности (рис. 1):

F(x) F(u)

Рис. 1. Диффракция на круглом отверстии: f(x) - отверстие (или его изображение),
F(u) - Фурье-образ круглого отверстия.

Математически диффракция световой волны на круглом отверстии (диффракция Френеля) описывается прямым преобразованием Фурье:

Зная диффракционную картину F(u), можно восстановить изображение круглого отверстия f(x), выполнив обратное преобразование Фурье:

Для выполнения обратного преобразования Фурье в плоскости диффракционной картины необходимо расположить второе круглое отверстие (этот принцип используется в
камере-обскуре) или линзу. Способность линз выполнять преобразование Фурье лежит в основе многих оптических приборов, в том числе и микроскопа. Для микроскопии наиболее важным свойством этого преобразования является закон масштаба, который гласит, что чем меньше размеры объекта, тем больше размеры его диффракционной картины.

Простейшая схема микроскопа должна обеспечивать формирование диффракционной картины клетки, например, с помощью лазера (прямое преобразование Фурье), и приведение ее затем к понятному нам виду с помощью линзы (обратное преобразование Фурье). Можно вообще обойтись без линзы, если диффракционную картину регистрировать ПЗС-матрицей, а обратное преобразование выполнять на компьютере с помощью алгоритмов быстрого преобразования Фурье (Кули и Тьюки, 1965; Виноград, 1978). Главную роль в таком микроскопе будет играть источник когерентной световой волны - лазер.

Классическая схема микроскопа сложилась задолго до появления лазеров и компьютеров. Хотя благодаря исследованиям Аббе и Келера к концу XIX в. стало понятным, что источник света в микроскопе по условию когерентности должен быть точечным, технически реализовать это требование в полной мере не представлялось возможным. Вот почему оптики пошли другим путем, стараясь обеспечить равномерное освещение препарата с помощью специального устройства - конденсора.

Преобразование Фурье превращает постоянную величину в единицу. Поэтому равномерно освещенный фон поля зрения будет давать Фурье-образ в виде центрально расположенной светлой точки. Если в поле зрения окажется клетка, ее Фурье-образ будет умножаться на Фурье-образ фона. Умножение Фурье-образа на константу не изменяет его, поэтому обратное преобразование Фурье вновь даст изображение клетки на ровном фоне. Таким образом, если в микроскопе обеспечивается равномерное освещение поля зрения, то его оптическая система становится частично когерентной и требования к источнику света снижаются.

Таким образом, в микроскопе имеются две оптические системы (рис. 2). Первая из них включает в себя источник света, коллектор с полевой диафрагмой и конденсор с апертурной диафрагмой. Назначение этой системы - равномерно освещать препарат. Вторая система состоит из препарата, объектива и окуляра. Объектив выполняет прямое преобразование Фурье, а окуляр - обратное преобразование Фурье, проецируя с помощью хрусталика изображение объекта на сетчатку глаза. Параллельный ход лучей обеспечивается в микроскопе между конденсором и препаратом, а также между объективом и окуляром.

Рис. 2. Ход лучей в микроскопе с ICS-оптикой

Следует отметить, что эта схема относится к современным микроскопам, оптика которых скоррегирована на бесконечность (на объективах и окулярах нанесен знак ¥). В старых микроскопах с фиксированным рабочим расстоянием 160 мм между объективом и окуляром формировалось действительное, увеличенное и перевернутое изображение препарата.

Настройка освещения микроскопа по Келеру. В большинстве современных микроскопов реализован метод освещения, разработанный немецким оптиком Келером в конце XIX в. Принцип настройки освещения по Келеру заключается в точном совмещении двух описанных выше оптических систем микроскопа. Для этого необходимо выполнить следующие действия:

1. Подготовить микроскоп к работе и установить препарат.

2. Используя объектив с малым увеличением (х10), сфокусироваться на поверхность препарата.

3. Закрыть полевую диафрагму (если полевая диафрагма отсутствует, установить после коллектора непрозрачный экран с круглым отверстием в центре).

4. Полностью открыть апертурную диафрагму.

5. Изменяя положение конденсора по вертикали, добиться резкого изображения краев полевой диафрагмы (или круглого отверстия).

6. Почти до конца открыть полевую диафрагму (снять экран).

7. Установить апертурную диафрагму в соответствии с апертурой объектива (если делений нет, лучше оставить ее открытой).

8. При переходе на другой объектив повторить пп. 3-7.

Особенно важно выполнить точную настройку микроскопа при работе с объективами большого увеличения (х40 и х100), поскольку в этом случае требования к освещению резко возрастают. Однако и на малых увеличениях настройка полезна тем, что позволяет уменьшить яркость источника света, продлив тем самым срок его службы. Кроме того, правильное положение конденсора, полевой и апертурной диафрагм снижают нежелательные фазовые эффекты, которые проявляются в виде ложных контуров вокруг микрообъектов, искажая их действительные размеры и форму.

Поиск по сайту: