Микроскопические методы исследования микроорганизмов

Методы лабораторных исследований

При проведении микробиологической диагностики инфекционных болезней с целью их раннего и окончательного распознавания в современных лабораториях используют разные методы исследования.

Микроскопический (бактериоскопический, вирусоскопический)  изготовление и окраска мазков из исследуемого материала от больного и изучение его под микроскопом. Он дает возможность быстро обнаружить характерные морфологические особенности возбудителя и имеет важное значение при диагностике гонорреи, менингита, туберкулеза, лепры, сифилиса, вовратного тифа, оспы, малярии, лейшманиоза, токсоплазмоза и др.

Бактериологический метод сводится к посеву материала от больного на соответствующие питательныеи среды, выделением чистой культуры возбудителя и определения его вида, а, следовательно, и установление окончательного диагноза заболевания. Он имеет решающее значение при диагностике брюшного тифа, дизентерии, холеры, дифтерии, чумы и других болезней.

Серологический метод основан на выявлении специфических антител в сыворотке крови больных к определенному возбудителю. Для этого используют разные иммунологические (серологические) реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др. Например, при брюшном тифе часто ставят реакцию агглютинации Видаля, при бруцеллезе  реакцию Райта, при хронической гоноррее  реакцию связывания комплемента Борде-Жангу и др.

Биологический (экспериментальный) метод заключается в заражении чувствительных лабораторных животных выделенной чистой культурой возбудителя, исследуемым материалом или введении бактериальных токсинов и воссоздание типичной картины заболевания. Для этого используют белых мышей, крыс, гвинейских свинок, кроликов. Этим методом определяют и вирулентность микробов. С диагностической целью биологическую пробу часто используют при чуме, сибирке, туляремии, туберкулезе, крупозной пневмонии, полиомиэлите, клещевом энцефалите и др.

Аллергический метод дает возможность установить диагноз с помощью внутрикожных аллергических проб, которые обнаруживают состояние повышенной чувствительности к возбудителю или продуктам его жизнедеятельности (аллергенов). Этим методом широко пользуются при диагностике туберкулеза (проба Манту), бруцеллеза (проба Бюрне), туляремии и многих других болезней.

Для глубокого понимания, усвоения и логического применения бактериоскопического метода диагностики важное значение имеет фундаментальное изучение морфологии и ультраструктуры микробов, методов их простой и сложной окраски, выявление отдельных структур и включений в бактериальной клетке. С этой целью в лаборатории широко используют современные микроскопы  высокоинформативные оптические приборы.

Микроскопические методы исследования микроорганизмов

Микроорганизмы и вирусы очень малые по своим размерам, так что увидеть их невооруженным глазом невозможно. В то же время морфология микробов, их размеры, форма, взаимное расположение клеток, наличие или отсутствие жгутиков, внутренняя ультраструктура является очень важной их характеристикой и часто служит основой классификации. Ввиду этого, одним из важнейших методов исследования строения микроорганизмов является микроскопия. В основе современных микроскопических методов исследования лежит световая микроскопия с многочисленными ее разновидностями, такими как темнопольная, фазовоконтрастная, аноптральная, поляризационная, интерференционная, люминесцентная и др. При изучении анатомии и ультраструктуры вирусов используют электронную микроскопию.

Современная промышленность выпускает много видов микроскопов в зависимости от их назначения. В практической работе рутинных баклабораторий чаще всего пользуются микроскопами МБР-1, МБР-3.

Микроскоп состоит из механической, оптической и осветительной частей. К механической относят штатив, тубус, револьвер, предметный столик, макро- и микровинт, к оптической  объективы и окуляры, к осветительной  зеркало и конденсор.

В верхней части штатива есть тубус, в который вставляется окуляр, а снизу он имеет револьвер, в отверстия которого вставлено 3-4 обьектива. Вращая револьвер, можно установить любой обьектив под отверстие тубуса. Последний поднимается и опускается с помощью макро- и микрометрического винтов. Для грубого наведения изображения пользуются макровинтом. Более точно это делается с помощью микровинта. Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа и требует осторожного обращения с ним.

Предметный столик имеет круглую или прямоугольную форму. В его центре находится отверстие, над которым помещают предметное стекло с препаратом (мазком). В более совершенных микроскопах есть очень удобные предметные столики, которые с помощью специальных устройств перемещают предметное стекло в двух взаимо перпендикулярных направлениях.

Самой ценной частью микроскопа являются обьективы, которые состоят из нескольких линз в общей металлической оправе. Обьективы разделяются на сухие (х8, х40) и имерсионные (х90 х120). Сухими называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и предметным стеклом находится воздух. При этом, в связи с разницей показателей преломления стекла и воздуха (соответственно 1,52 и 1,0), часть световых лучей не попадает в глаз исследоавтеля. Имерсионными называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и исследуемым обьектом находится кедровое, персиковое масло или "имерсиол", коэффициент преломления света которых такой же, как и у стекла. При исследовании морфологии микроорганизмов пользуются преимущественно имерсионными обьективами, которые часто называют имерсионной системой.

Важнейшей характеристикой любого обьектива является его разрешающая способность. Это наименьшее расстояние между двумя точками, при которой они еще видимы раздельно, то есть не сливаются в одну. Разрешающая способность обьектива ограничена такими явлениями, как хроматическая и сферическая аберрации, дифракция и др. Если оба вида аберрации можно устранить, то явление дифракции существует в любой оптической системе и его устранить или, хотя бы, уменьшить практически невозможно. Дифракция в значительной степени ограничивает разрешающую способность микроскопов.

Следовательно, при пользовании даже наилучшими имерсионными обьективами невозможно увидеть обьекты, которые имеют размеры меньше 0,2 мкм. Полезное увеличение обьектива не может превышать нумерическюу апертуру больше, чем в 1000 раз. Таким образом, максимальное полезное увеличение современных микроскопов при использовании имерсионных обьективов с апертурой 1,40-1,60 достигает 1400-1600.

Окуляр состоит из двух линз и только увеличивает изображение, которое выходит из обьектива, не добавляя к нему никаких деталей. Существуют окуляры с такими увеличениями: х7, х10, х15. Эти цифры обозначены на них.

Осветительный аппарат находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало направляет пучок света в конденсор, а через него в обьектив микроскопа. Одна сторона зеркала вогнутая, вторая плоская. При микроскопировании с конденсором необходимо пользоваться лишь плоским зеркалом. Конденсор Аббеа состоит из системы линз для сбора пучка лучей в одной точке (фокус), которая находится в плоскости исследуемого препарата. При работе с дневным освещением конденсор нужно поднимать к уровню предметного столика, с искусственным опускать до тех пор, пока изображение источника света не появится в плоскости, препарата. При исследовании неокрашенных препаратов конденсор также опускают.

Обьем света в соответствии с потребностями исследования регулируется диафрагмой, которая находится под конденсором. Она может сужаться и расширяться подобно зенице глаза (отсюда название ирис-диафрагма). Окрашенные препараты рассматривают при открытой, а неокрашенные  при суженой диафрагме.

Современные микроскопы имеют ряд усовершенствований, благодаря которым улучшается изображение и расширяются границы видимости. Первое достигнуто выпуском микроскопов-бинокуляров, второе  исследованием в темном поле зрения. Бинокулярный микроскоп имеет специальную насадку с двумя тубусами (бинокулярная насадка). Это создает ряд преимуществ при микроскопировании. Исследуемый препарат рассматривают сразу обоими глазами, что не вызывает переутомления органа зрения. При этом одновременно достигается большая четкость глубины изображение и его пластичность.

С целью фундаментальных исследований морфологии микроорганизмов и других клеток оптическая промышленность выпускает более совершенные микроскопы. Одним из них является микроскоп универсальный биологический исследовательский МБД-15. С его помощью можно проводить широкий обєм микроскопических исследований: визуальное наблюдение, использования светлого и темного полей зрения в прямом, косом и отраженном свете, метода фазовых контрастов, люминесцентной и интерференционной микроскопии. Для микрофотографирования исследуемых обьектов микроскоп оснащен фотоаппаратом с автоматическим затвором, фотоэкспонометром и импульсной лампой.

При изучении динамики развития и размножения микроорганизмов, действия на них разных физических и химических факторов, образования L-форм и других проблем изготовляют специальные микроскопы с микроустановками для цейтраферной (прерывистой) микрокиносъемки особенно с использованием метода фазовых контрастов.

Правила работы с имерсионной системой:

1. Поднять конденсор Аббеа к уровню предметного столика, полностью открыть ирис-диафрагму.

2. Пользуясь обьективом 8, с помощью плоского зеркала добиться максимального освещения поля зрения.

3. На предметном столике разместить окрашенный мазок препарата, нанести на него кедровое масло и закрепить клеммами.

4. Возвращая револьвер, установить над препаратом имерсионный обьектив 90, под контролем зрения опустить его в каплю кедрового масла.

5. Глядя в окуляр левым глазом (не закрывая правого), сначала с помощью макровинта найти контуры изображения, потом, пользуясь микровинтом, достичь максимальной четкости, ичить и зарисовать препарат.

6. По окончании работы поднять тубус, снять предметное стекло, осторожно вытереть имерсионный обьектив от кедрового масла, повернуть его в сторону, опустить тубус.

Освещение за методом Келлера. Наилучшие результаты микроскопии при субьективних исследованиях и микрофотографировании можно получить лишь при условии четкого центрирования всех оптических частей микроскопа, включая и систему освещения. Этого достигают при использовании метода Келлера.

1. Заводскойосветитель с "точечным" источником света устанавливают на растоянии 25-30 см от микроскопа так, чтобы плоское зеркало отбрасывало световое пятно диаметром около 8 мм на закрытую диафрагму конденсора. За этим процессом следят с помощью зеркальца, размещенного на правой ножке микроскопа.

2. На предметный столик кладут препарат, пользуясь сухими обєктивами (8х, 40х), наводят четкое изображение, снимают окуляр и на верхний конец тубуса кладут матовое стеклышко. На нем видно изображение обьекта в центре светового пятна. При необходимости установку корегируют. Открывают к оптимальному диаметру отверстие диафрагмы конденсора.

3. Устанавливают необходимый обьектив и окуляр (лучше 10х) и приступают к изучению или фотографированию исследуемого обєкту.

Мазки препаратов следует изготовлять на предметных стеклах толщиной не более 1,1-1,4 мм

Темнопольная микроскопия отличается от обычной имерсионной световой способом освещения препарата. В обычном микроскопе обьект исследуют при свете, который проходит, в темнопольном  при боковом освещении. Для микроскопии в темном поле используют вместо конденсора Аббе специальный конденсор (кардиоид-конденсор) параболоида, в котором боковая поверхность зеркальная, а центральная часть нижней линзы затемнена, в результате чего образуется темное поле зрения. Яркие боковые лучи, отражаясь от зеркальной поверхности, фокусируются в плоскости обьекта, но в глаза микроскописта не попадают. В обьектив проникают лишь те лучи, которые оттражаются частичками препарата благодаря преломлению или дифракции. Следовательно, на темном поле зрения микробные клетки и другие мелкие частицы выглядят очень яркими. Картина напоминает мигающие звезды на темном небе.

Темнопольный микроскоп дает возможность рассматривать обьекты размером 0,02-0,04 мкм, то есть значительно меньше, чем под обычным световым микроскопом. Потому темнопольный микроскоп часто называют ультрамикроскопом. Микроскопию в темном поле зрения используют для исследования подвижности бактерий, выявления возбудителей сифилиса, лептоспироза, возвратного тифа. Но при этом нельзя хорошо изучить внутреннюю структуру микроорганизмов. Для этой цели предложенны видоизмененные методы оптической микроскопии: фазово-контрастная, аноптральна и люминесцентная.

Фазовоконтрастна микроскопия  способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света обьектов, который базируется на усилении контраста изображения. Он заключается в том, что живые клетки (бактерии), слабо поглощая свет, все же способны изменять фазу проникающих лучей. В разных участках клетки толщина, плотность, а, следовательно, и показатели преломления света будут неодинаковы. Эту разницу в фазах ни орган зрения, ни фотопленка не замечают. Но их можно сделать видимыми с помощью специального фазовоконтрастного устройства. Он включает у себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, которые обеспечивают освещение препарата полным конусом света, и фазовоконтрастные обьективы. Они отличаются от обычных обьективов тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца. Именно она вызывает сдвиг фазы света, который проходит через нее. Это позволяет сделать неокрашенные препараты четко видимыми.

При работе из фазовоконтрастным микроскопом клетки могут выглядеть темными (позитивный фазовый контраст) или светлыми (негативный контраст) в сравнении с окружающим фоном. Этот вид микроскопии не увеличивает разрешающей способности, но позволяет обнаружить новые детали внутренней структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения под воздействием антибиотиков и других химиопрепаратов. Он имеет и некоторые недостатки: слабая контрастность изображений, наличие сияющих ореолов вокруг исследуемых обєктів. Значительные преимущества перед фазовоконтрастним микроскопом имеет аноптральний микроскоп.

Люминесцентная микроскопия в последнее время широко используется в микробиологических исследованиях. Этот метод позволяет наблюдать первичную или вторичную люминесценцию (свечение) микроорганизмов, клеток, тканей и отдельных их структур. Изображение в люминесцентном микроскопе возникает из-за свечения самого препарата, которое возникает при освещении его коротковолновой частью спектра. Метод основан на использовании явления флуоресценции. Так как большинство болезнетворных микробов не имеют первичной (собственной) люминесценции, их сначала обрабатывают слабыми растворами специальных красителей (флуорохромов), которые связываются определенными структурами живых бактерий, не нанося им вреда. Чаще всего применяют такие флуорохромы: акридиновый оранжевый, аурамин, корифосфин, изотиоцианат флуоресцеина, трипафлавин и др.

Лучи света от сильного источника, например, ртутной лампы избыточного давления, пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием такого облучения окрашенные флуорохромом бактерии начинают светиться красным, зеленым, желтым или другим цветом. Так, при окраске дифтерийных палочек корифосфином они приобретают желто-зеленое свечение, а при обработке аурамин-родамином возбудитель туберкулеза светится золотисто-оранжевым цветом.

Метод люминесцентной микроскопии намного более чувствительный сравнительно с другими микроскопическими исследованиями. Он позволяет обнаружить такое малое количество возбудителя, которое другими методами не находят. По характеру люминесценции можно дифференцировать отдельные химические вещества, которые входят в состав микробных клеток. Использование люминесцентного микроскопа имеет ряд преимуществ: цветное изображение, высокая контрастность, возможность исследовать как живые, так и убитые микроорганизмы.

Люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления антигенов и антител (метод иммунофлуоресценции). С ее помощью можно увидеть микробы, которые содержат определенные антигены. Для их выявления необходимо иметь специфические люминесцентные сыворотки, которые вызывают флуоресценцию именно данного антигена. Этот метод успешно используют для экспресс-диагностики многих бактериальных и вирусных заболеваний.

Кроме люминесцентного устройства ОІ-17 и специальных осветлителей ОІ-18, ОІ-28, ОСЛ-1, бактериологические лаборатории оснащенные люминесцентными микроскопами МЛ-2, МЛД-1 и др. Модель МЛ-2 имеет большой комплект оптики, фильтров, фотонасадку, дает возможность проводить одновременно комбинированные наблюдения: люминесцентное при освещении препарата сверху и фазовоконтрастное в проходящому свете.

Электронная микроскопия. Для изучения строения микроорганизмов на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для исследования структуры и архитектоники вирусов используют электронный микроскоп. Это высоковольтный вакуумный прибор, в котором увеличенное изображение получают с помощью потока электронов. Он обладает высокой разрешающей способностью и может давать увеличение от 20 тыс. до 5 млн. раз. По принципу действия различают трансмиссионные, сканирующие (растровые) и комбинированные электронные микроскопы.

Принципиальная схема трансмиссионного электронного микроскопа мало чем отличается от обычного оптического. Возможности светового микроскопа ограничены не качествами линз, а большой длиной световых волн (0,29-0,8 мкм). Малая длина волны электронов (0,0002 мкм и даже меньше) позволяет значительно увеличить разрешающую способность электронного микроскопа. Вместо света в нем используют поток электронов, источником которых является вольфрамовая нить, которая нагревается электрическим током (электронная пушка). Роль линз оптического микроскопа выполняет круговое электромагнитное поле. Пучки электронов, проходят через исследуемый обьект, отклоняются под разными углами в зависимости от неодинаковой толщины и плотности разных участков препарата и попадают в обьективную линзу. В ней появляется первое полезное увеличение обьекта.

После линзы обьектива электроны попадают в промежуточную линзу, которая служит для плавного увеличения изображения. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение обьекта, которое направляется на флюоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана возникает видимое изображение обьектов. После наведения четкости проводят фотографирование.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки обьектов исследования. Необходима специальная фиксация тканей или бактерий, их тщательное обезвоживание, заливка в эпоксидные смолы, изготовление ультратонких срезов. Для повышения четкости изображения используют методы позитивного и негативного контрастирования и оттенения.

Широко также используют ультратонкие срезы клеток, бактерий и вирусов, что дает возможность исследовать их структуру на субклеточном и молекулярном уровнях.

Современная украинская и зарубежная промышленность выпускает много моделей электронных микроскопов, которые имеют огромные возможности для изучения микроскопического мира.

Методы электронной микроскопии привели к большим успехам в развитии таких наук как цитология, бактериология, генетика и, особенно, вирусология. Успешно развивается иммунная электронная микроскопия, которая дает возможность определить родовую принадлежность вирусов, что используется для экспресс-диагностики многих вирусных инфекций.

Поиск по сайту: