I. Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.

1. Приготовьте предметное стекло, спиртовку, пробирку с физиологическим раствором, бактериологическую петлю и пробирки с исследуемыми культурами, растущими на плотных и (или) жидких питательных средах. Зажгите спиртовку, предварительно её проветрив, приподняв фитиль и канюлю. Спиртовка должна находиться прямо перед Вами, на удобном для работы расстоянии. Для стерилизации петлю прокалите в пламени спиртовки, остудите сначала в воздухе в течение 2-3 с., затем о внутреннюю поверхность пробирки (ниже верхней трети длины). Заберите физиологический раствор (0,9% р-р NaCl) и нанесите каплю на чистое обезжиренное предметное стекло. Стекло должно находится в чашке Петри; категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! Вновь прокаленной и остуженной петлей возьмите немного биомассы, прикоснувшись к ней петлей. Культуру суспензируют в капле физиологического раствора до появления легкой мути, после чего остатки биомассы на петле необходимо высушить и сжечь в пламени спиртовки. Микробную взвесь на стекле распределите остуженной петлей тонким равномерным слоем на площади диаметром 1-1,5 см. После приготовления мазка петлю сразу обязательно прокалите и поставьте в штатив.

Мазок из жидкой культуры готовят также, но без использования физиологического раствора.

Препарат из культур №1 и №2 готовится в том же порядке с последовательным внесением исследуемых культур в каплю физиологического раствора..

2. Полученный препарат высушите на воздухе в чашке Петри. Запрещается покидать рабочее место и оставлять мазок без присмотра!

3. Высушенный препарат зафиксируйте путем 3-х кратного проведения через пламя спиртовки мазком вверх так, чтобы общее время пребывания его в пламени было около 6 с. Контролем правильности фиксации препарата служит прикосновение стекла к тыльной стороне ладони; стекло должно быть горячим, а не теплым. В противном случае фиксацию необходимо повторить. После того, как стекло остынет, границы мазка обведите стеклографом с нижней стороны. Цель фиксации: инактивация микроорганизмов; прикрепление микроорганизмов к стеклу; улучшение проникновения красителя внутрь микробной клетки.

4. Препарат из смеси культур №1 и №2 окрасьте по методу Грама: поместите на препарат бумажку, пропитанную раствором генцианвиолета (модификация Синева), смочите ее водой, через 1-2 мин бумажку снимите, а краску слейте; налейте раствор Люголя на 1 мин, слейте; обесцветьте 96°спиртом в течении 10-30 сек. до прекращения отхождения струек краски; промойте водой; докрасьте водным фуксином (1:10) в течение 1-2 мин, промойте водой; высушите фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные – в розово-красный цвет, что связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.

Для получения достоверного результата при окраске по методу Грама необходимо точно соблюдать правила приготовления мазков, продолжительность окраски и обесцвечивания спиртом. Толстые, густые мазки будут окрашиваться неравномерно и заведомо грамотрицательные бактерии могут окраситься грамположительно. При окраске тонких мазков основная ошибка заключается в «переобесцвечивании» мазка спиртом и поэтому грамположительные бактерии окрашиваются грамотрицательно. Имеет значение и возраст культуры. В старых культурах грамположительные бактерии могут окраситься грамотрицательно.

Метод окраски, при котором применяется два и более реактива, называется сложным. В микробиологической практике этот метод имеет дифференциально-диагностическое значение.

Поиск по сайту: