Микробиологический контроль дрожжей методом микроскопирования

При проведении микробиологического контроля дрожжей оценивают их физиологическое состояние на всех технологических стадиях производства. Микроскопирование производят методом раздавленной капли с прижизненной окраской метиленовой синью или применяют окрашенные фиксированные препараты.

При микробиологическом контроле засевных дрожжей перед подачей их в дрожжерастильные определяют:

1) инфицированность дрожжей;

2) общее количество клеток в 1 см³ среды;

3) количество почкующихся клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

4) количество мертвых клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

5) морфологические характеристики и физиологическое состояние дрожжей (величину клеток, состояние протоплазмы, наличие вакуолей и включений);

6) соотношение гликогенсодержащих клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения).

Контрольные показатели при микроскопической оценке засевных дрожжей следующие:

– количество почкующихся дрожжей – 15…25 %;

– количество мертвых клеток – 0,5…1 %;

– посторонних микроорганизмов – не более 1…2 клеток в поле зрения;

– клеток физиологически молодых – 20…25 %.

При определении степени инфицирования культуры количество посторонних микроорганизмов просчитывают не менее чем в пяти полях зрения.

Определение степени инфицированности дрожжей

В нескольких каплях стерильной воды размешивают петлю дрожжей. Для приготовления препарата каплю дрожжевой суспензии из средней пробы наносят на предметное стекло, добавляют каплю метиленового синего и готовят препарат раздавленная капля. При микроскопировании не должны быть обнаружены подвижные формы бактерий, микромицетов и диких дрожжей, неподвижные кислотообразующие бактерии допускаются в количестве не более 1…3 штук в поле зрения микроскопа.

Большее количество бактериальных клеток свидетельствует о наличии инфекции, которая может привести к значительному нарастанию кислотности сусла, так как бактериальная инфекция зрелых дрожжей обычно бывает кислотообразующей.

Определение общего количества дрожжевых клеток

Общее количество засевных дрожжей определяют методом прямого подсчета их в счетных камерах.

Перед взятием пробы дрожжи в дозаторе тщательно перемешивают, отбирают среднюю пробу, а из нее 10 см³ среды. Пробу, не фильтруя, разводят в 10 раз водой и тщательно взбалтывают в течение 1 мин. Затем тонкой пипеткой отбирают небольшую каплю дрожжевой суспензии и наносят ее на среднюю пластину камеры.

Подсчет дрожжевых клеток производят немедленно после отбора пробы, иначе количество дрожжевых клеток не будет соответствовать истинному.

Хорошие засевные дрожжи должны содержать 120…160 млн клеток в 1 см³ дрожжевой суспензии.

Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях). Метод имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах производится учет всех клеток микроорганизмов без диффереренциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе 8…40 х.

Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные площадки. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рисунок 4.1а). Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рисунок 4.1б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла.

а – вид сверху; б – вид сбоку;в – вид при малом увеличении микроскопа

Рисунок 4.1 – Счетная камера Горяева

Сетка разделена на определенное количество больших и маленьких квадратов, по разному сгруппированных (рисунок 1в).

Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат (АВСD), сторона которого равна 1/20 мм (0,05 мм), площадь его 1/400 мм² (0,0025 мм²), а объем при высоте камеры 1/10 мм (0,1 мм) – 1/4000 мм³ (0,00025 мм³) или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСD состоит из 16 малых квадратиков.

Камера Горяева имеет площадь 9 мм², объем камеры – 9 мм³ и разбит на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду).

Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна быть равномерно без пузырьков распределена по всей сетке, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец.

Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 40 х (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов).

Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т.е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитываются все клетки, размешенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают.

Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в пяти больших квадратах (80 малых) – 240 клеток, тогда в одном малом квадратике среднее количество клеток 240:80 = 3 пересечет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по формуле

где N – число клеток в 1 мл суспензии;

a – среднее число клеток в малом квадрате;

h – глубина камеры, мм

S – площадь малого квадрата, мм²

К – разведнение исходной суспензии;

1000 – коэффициент пересчета мм³ в мл (1 мл = 1000 мм³).

Результаты работы оформляют в виде таблицы (таблица 4.1).

Таблица 3 – Количественный учет микроорганизмов в камере Горяева

Определение количества почкующихся и мертвых дрожжевых клеток

На предметное стекло наносят каплю дрожжей и каплю раствора метиленового синего (1:5000), накрывают покровным стеклом и отбирают излишек жидкости фильтровальной бумагой. Через две минуты препарат микроскопируют, подсчитывая количество всех дрожжевых клеток в поле зрения микроскопа, затем количество почкующихся клеток, затем только синих (мертвых – оболочка мертвых клеток пропускает краситель).

Подсчет повторяют не менее чем в пяти полях зрения микроскопа.

Количество почкующихся и мертвых клеток выражают в %.

Определение физиологического состояния дрожжей

Вид дрожжевых клеток меняется в зависимости от возраста и условий выращивания.

Физиологически молодая дрожжевая клетка характеризуется наличием тонкой клеточной оболочки, гомогенной (однородной) протоплазмы, практически не содержащей вакуолей. Протоплазма плотно прилегает к оболочке клетки.

По количеству и величине вакуолей можно судить о возрасте дрожжевой клетки: количество и объем их увеличивается по мере созревания и у старой культуры занимает почти всю клетку.

Ослабленные и мертвые клетки, обычно меньшего размера, темные, окрашенные, у клеток, подверженных лизису, нарушена оболочка, протоплазма окрашена и отходит от клеточной стенки.

Размножающаяся физиологически молодая культура дрожжей должна содержать не менее 25 % почкующихся клеток.

Определение гликогена в дрожжевых клетках

Гликоген – запасное питательное вещество дрожжей, содержание его в дрожжевой клетке непостоянно и изменяется в зависимости от ее возраста и состояния. В молодых клетках гликоген отсутствует, они окрашиваются йодом в светло-желтый цвет. По мере созревания дрожжей количество гликогена растет и к моменту сбраживания 2/3 сахаров сусла (когда засевные дрожжи готовы к инокуляции), его количество максимально. В нормальных зрелых дрожжах гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объёма клетки и имеет вид красно-коричневых включений. Если гликогена меньше 1/4 объема клетки, его содержание считают недостаточным, а дрожжи – перезревшими или плохо упитанными (голодными). В 70 % зрелых производственных дрожжей должен содержаться гликоген.

Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю дрожжей и 2…3 капли 0,5 %-ного раствора йода. Капли смешивают, покрывают покровным стеклом, удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой.

Через 2…3 минуты цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, гранулы гликогена – в красно-коричневый.

Поиск по сайту: