Суспензионды культуралар

Жасушалық және гендік биотехнология алдына қойылған міндеттерді шешу үшін жүйе қажет. Ол клеткалық селекция, генетикалық трансформация, клондау, соматикалық гибридизация (15,3,7) жүргізуге мүмкіндік береді. Қазіргі таңда перспективті клеткалық жүйе болып жасушалардың суспензионды культуралары болып табылады.

Суспензионды деп сұйық қоректік ортада өсірілетін жасушалар культурасын айтады. Бөлек жасушалар, кіші топтар және үлкен агрегаттар (50 жасушадан аса) ілінген күйде өсіріледі. Суспензионды культура алу рандомикалық жағдай болып табылады. Тек қана метаболизмнің қайта құрылуына және берілген суспензияны өсіру жағдайында жоғары коэффициентпен көбеюге қабілетті жасушалар ғана «жақсы» линиялар түзеді. Жасушалардың суспензионды культурасы салыстырмалы гомогенді жасушалық популяция болып табылады (18). Мұндай линиялардың маңызды сипаттамасы жоғары дәрежедегі дезагрегация, цитоплазма, трахеидотәрізді жоқтығы болып табылады.

Суспензиялы культуралардың каллустарға қарағандағы бір артықшылығы клеткалардың өсуімен метаболизмнің реттеушілігін анағұрлым қатал іске асыратын біркелкі клеткалы популяцияларды алу мүмкіншілігі; бұндай культура жоғары дәрежеде физиолого-биохимиялық, молекулярлық-биологиялық және т. б. зерттеулердің шарттарын қанағаттандырады.

Суспензиялы культураларды алудың негізгі әдісі дифференцирленбеген каллустың бөлшегін араластырылып отыратын сұйық ортаға орналастыру болып келеді (8,16,35). Суспензияны алу үшін морфогенезге қабілетсіз, агарланған ортада бос, қарқынды өсетін каллусты ұлпалар алынады. Неғұрлым агарланған ортада біркелкі және бос ұлпа болса, соғұрлым суспензияға жеңіл енеді. Біріншілік суспензия үшін 250, 500 немесе 1000 мл көлемдегі колбаларға сұйық қорек ортаның 100 мл-на 3-5г бос ұлпасын орналастырады. Біріншілік суспензияның көлемі колба көлемінің 10%-ін құру қажет. Осыдан кейін колбаларды шайқағышқа орналастырады. Өсірудің бірінші цикл ұзақтығы штаммның ерекшеліктеріне байланысты болып келеді, бірақ әдетте 3 аптаға тең келеді. Сол уақытта 3 процесс өтеді: инокуляттың дезагрегирленуі, клеткаларды араластыру мен орналастыру кезіндегі зақымдалғандардың өлімі және жеке клеткалар мен агрегаттардағы клеткалардың көбеюі. Сондықтан каллусты ұлпаларды сұйық ортаға орналасқаннан кейінгі алғашқы күндері суспензияның бұлдырауы байқалады. Кейіннен, пролиферация активтенгенде, суспензия ағарады және колбаның беткі қабатында тірі клеткалардың бір қабаты түзіледі. Оы периодта суспензиялы культураны жаңа ортаға отырғызуға болады. Суспензиялы культурадағы клеткалар үшін келесі сипаттамалар тән: олар бөлінуге қабілетті болып тұрса да, құрамында көптеген ірі вакуольдері бар; цитоплазманың белсенді қозғалуын көрсететін, жақсы ажыратылған цитоплазматикалық тартылыстың болуы; ядрошығы бар ірі ядроның болуы.

Біріншілік суспензияны алғаннан кейін тығыз ірі агрегаттарды жою үшін оны фильтрлейді. Суспензияның агрегирленуі бастапқы экспланттың сипаттамаларына ғана байланысты емес, сонымен қатар культивирлену шарттарына да байланысты болып келеді (рН, бөлінетін фенолдардың токсикалық әсері, азоттың көзі, гормональді байланыс, газдық құрам, аэрация, жарықтандыру шарттары, көмірсулы және минералды қоректену) (1,16).

Суспензияда клеткаларды культивирлеу кезінде организмнен тыс культивирленудің нәтижесінде клеткалардың кең генетикалық ауытқулары, біреулерінің жойылуы және басқа берік модификациялардың түзілуі, фенотипті және генотипті клеткалар линияларының бейімделгіштік сұрыпталуы байқалады. Клеткалық селекция үшін тез өсетін,эмбриогенді клеткалық суспензиялар қолданылуы мүмкін. Бұндай суспензиялар темекі, сәбіз, беде, лилия, петуния, қауын және басқа да өсімдіктерден алынған (9,19). Астықтұқымдастардың суспензиялы культураларын алу анағұрлым күрделі (әсіресе эмбриогенділердің) және ол өсірілетін клеткалардға қойылатын шарттар мен қатал талаптарға байланысты. Эмбриогенді типтегі суспензиялы культуралар күріштен, жүгеріден, қант қызылшасынан және т. б. алынған. Бидайдың суспензиялы культуралары салыстырмалы түрде жақында ғана алынған болатын.

Эмбриогенді суспензиялы культураны каллустық эмбриогенді аймақтан алады. Клеткалы популяциялардың гетерогенділігін жеңу үшін каллус деңгейінде селекцияны өткізеді де, белсенді өсетін, жас, тұрақты экспланттарды бөліп алады және белгілі бір типтегі клеткаларды культивирлеу шарттарын анықтап, клетка деңгейінде өткізеді.

Эмбриогенді суспензияның қалыптасуы бірнеше кезеңдерден өтеді. (8)

Культивирлеудің бастапқы кезеңдерінде беткі өсірілген каллус клеткаларының терең культивирлеу шарттарына бейімделуі өтеді; осмостық ортаның, газдық құрамының, қорек заттардың жету дәрежесінің жарықтандырудың өзгеруінен болатын метаболизмнің маңызды қайта құрылулары жүреді (21).

Қалыптасқан клеткалы суспензия қаныққан сары түске, жоғары дисперстілікке және эмбриогенді суспензияның басқа да қасиеттеріне ие болады. Белсенді өсіп келе жатқан суспензия міндетті түрде суспензиясының бөліну орталықтары (бірліктері) болып келетін агрегаттардан құралған. Суспензиялы клеткаларды агарға плоттау кезінде 2-2,5 айдан кейін микроколонияларды және әрі қарай каллустарды түзеді.

Суспензиялық культурадан оқшауланған протопластарды алу әдістемесін қолдана отырып клеткалық линияларды және әрі қарай ерекше қасиеттері бар өсімдіктерді алуға болдаы, әртүрлі клеткалық суспензиялардан протопластардың қосылу мүмкіндігі ашылды. Өте сезімтал модельді жүйелер бола отырып, суспензиялы клеткалар мутагендердің, селективті орталар мен патогендердің әсерінен кең спектрлі ауытқуларды көрсетеді. Спецификалық әдістерді қолдана отырып, саңырауқұлақтың токсиндерін, гербицидтерге, тұздануға т.б. төзімді клеткалық линияларды бөліп алуға болады.

Картоп каллусынан суспензиялы культураларды алу әдістемесі

Картоптың суспензиялы культурасын алу үшін 2,5 мг бос каллусты ұлпасын 100 мл сұйық қорек ортаға орналастырады (5 кесте) және 25±1^оC температурада колбаларда әрдайым шайқай отырып, қараңғыда, ауаның 80-85% салыстырмалы ылғалдылықта өсіреді.

5 кесте

Картоптың суспензиялы культураларын алу үшін қорек орталар

Ескерту: орта рН 5,7-5,8.

3-4 жұмадан кейін колба қабырғасында ақшыл клеткалардан тұратын «жиек» түзіледі, бұл клеткалық суспензияның қажетті тығыздыққа жеткенін және оны қайтадан отырғызу керек екендігін көрсетеді.

Поиск по сайту: