Кіріспе. Клеткалық инженерия – биотехнолгияның маңызды бағыттарының бірі

Клеткалық инженерия – биотехнолгияның маңызды бағыттарының бірі. Ол жаңа объектінің қолданылуына – эукариот ағзалардың, клетка немесе ұлпалардың оқшауланған культурасы, сонымен қатар өсімдік клеткаларының ерекше қасиеті – тотипатенттілікке негізделген. Бұл объектті қолдану ауқымды теориялық және практикалық есептерді шешуге үлкен мүмкіндіктер ашты. Фундаментальді ғылым саласында ұлпаларда болатын клеткааралық өзара әсер, клеткалық дифференциация, морфогенез, клетканың тотипатенттілігін іске асыру сияқты күрделі мәселелерді зерттеу мүмкін болды.

Өсімдіктердің клеткалық инженерясы қазіргі кезде көптеген мәліметтер жинап, біртіндеп генетикада оқытылатын академиялық пәндерден биотехнолгияның маңызды саласына айналды. Біріншіден, бұл клеткалық деңгейде манипуляциялауға болатын өсімдіктер ауқымының кеңеюіне байланысты. Бұдан басқа, жоғары сатыдағы өсімдіктердің клеткалық инженериясына қызығушылық танытқан өсімдіктердің генетикалық трансформациясының тиімді әдістерінің пайда болуымен арта түсті.

Өсірілетін клеткалардың ерекше қасиеті in vitro-да бүтін өсімдікді регенерациялау, оларды клональді микрокөбейту үшін, өсіру және сұрыптау материалдарын патогенді емес, таза өндіріс үшін қолдануға мүмкіндік береді. Құнды екіншілік метаболиттерді синтездеуге қабілетті өсірілетін өсімдік жасушаларын дәрілік, тағамдық, бояу заттарын өндірістік әдіспен алу мақсатында жасушалық технологияны құру үлін пайдаланылады.

Клеткалық инженерияның зерттеу саласы ретінде оқшауланған мүшелер, ұлпалар, және клеткаларды өсіру әдістері-физиология, биохимия, генетика, өсімдіктердің цитогенетикасында кең қолданылып жұр, сондай-ақ жаңа алғашқы материалдарды құру, оны сақтау және ұстау үшін де практикалық маңызы зор. Клеткалық инженерия облысында зерттеулерді дамыту бойынша тәжірибелі мамандарды дайындаусыз мүмкін емес екені көрініп тұр. Сонымен бірге өсімдіктердің клеткалық инжененириясында қолданылатын негізгі әдістерді сипаттайтын практикалық оқу құралдары өте аз.

Бұл жұмыста сипатталған барлық әдістерді үш топқа бөлуге болады. Басында in vitro культурасынның әдістері сипатталған, содан кейін – жасушалық генетика инженерия әдістері (протопласттардың трансформациясы және құйылысуы), және соңында ұлпа және жасуша культураларынан өсімдіктердің регенерациясы қолданылатын әдістер. Әдістер М.А.Айтхожин атындағы молекулярлы биология және биохимия Институтының ҚР БҒМ, биология және өсімдіктер биотехнологиясы Институтының ҚР БҒМ, жасушалық және генетикалық инженериясы лабораторияларында пайдаланылатын модификацияда сипатталған, сонымен қатар жұмыста картофель культурасы бойынша авторлық жетілдірулер айтылған (Тұрпанова Р.М.).

Жұмыс соңында қандай да бір мақсат немесе объектке байланысты әдістемелер сипаттамасы және олардың модификациясын табуға болатын әдебиеттер тізімі берілген. Әрине, мұндай кіші жұмыста өсімдіктердің жасушалық инженериясында қолданылатын барлық әдістерді сипаттау мүмкін емес. Бірақ авторлар келтірген әдістемелер жаңа зерттеушілерге көмегін тигізеді деп үміттенеді.

1. Лабораторияға қойылатын негізгі талаптар

1.1 Лаборатория

Жасушалық генетикалық инженерия бойынша жұмыстар жүргізу үшін келесі операцияларды өткізуге мүмкіндік тудыратын арнайы жабдықталған лаборатория қажет: 1 – ыдыстарды жуу және сақтау, 2 – ыдыс, инструмент және материалдарды залалсыздандыру, 3 – қоректік орталарды дайындау, залалсыздандыру және сақтау, 4 – бастапқы материалдарды асептикалық манипуляциялау үшін, 5 – бақыланатын жағдайда культураларды өсіру, 6 - өсіру объектілерін зерттеу

Жуу бөлмесі. Бұл бөлмеде дайындау жұмыстары жүреді: ыдыстарды жуу және кептіру. Бөлме ыстық және салқын су келетін үлкен раковинамен, сонымен қатар жуылған ыдысты дистилденген сумен шаю үшін дистиллятормен, 100-130˚С температурасы бар кептіргіш шкафпен, ыдысты сақтауға арналған стеллаждармен, жуғыш заттарын сақтауға арналған ыдыстармен қамтамасыз етілуі тиіс. Инструменттер, материалдар және қоректік заттарды залалсыздандыруға арналған бөлме автоклав, 140-200˚С температурасы бар кептіргіш шкаф, залалсыздандырылған қоректік орталар, материалдар, стелаждарды орналастыратын үстелдермен жабдықталады.

Қоректік орталарды дайындауға арналған бөлме: лабораториялық үстел, ыдыстар мен реактивтерді сақтауға арналған тоңазытқыштар, аналитикалық, электронды таразылар, рН – метр, магнитті араластырғыш, су банясымен жабдықталуы тиіс.

Культуральды бөлме: кондицирленетін ауасы бар, (25±2˚С) температурасы бар, салыстырмалы ылғалдығы 70%, жарақтық интенсивтілігі 5-тен 10 люкске дейін болатын өздігінен реттелетін бөлме. Бұл үшін культуральды бөлмені шыны стеллаждармен, күндізгі жарық лампаларымен, кондиционермен, качалкамен жабдықталуы тиіс және бөлменің терезелері болмауы қажет.

Залалсыздандыру жұмыстарын жүргізуге арналған бөлме.

Суспензионды культура, субкультивирленген каллус, әртүрлі экспланттарды бөлу, протопласттарды құйылыстыру және т.б. жұмыстарды жүргізу үшін залалсыздандырылған ауамен қамтамасыз ететін ламинар боксты қолданады. Бұл үшін бөлмеде ламинар боксты қондырады, бактерицидті лампалар болуы қажет, ол жұғу ошақтарынан оқшауланған болуы тиіс, сонымен қатар терезе және газ құбырлары болмауы керек. Төбе, қабырға және еден беттері тегіс, дезинфикация ерітінділеріне тұрақты болуы қажет, себебі барлық беттер периодты түрде олармен өңделіп отырады. Ламинар бокста фотонасадкалармен инвертирлі, бинокулярлы микроскоптар, газ шам, инструменттерді залалсыздандыру үшін спирті бар фарфор стаканы, пипеткалар, Петри табақшалар, залалсыздырылған суы бар колба, пробиркалар болады. Залалсыздандыру бөлмесінің алдында халат, аяқ киім, бас киім және қосымша залалсыздандыруды (кварц шамдары) қамтамасыз ететін тамбур болған дұрыс.

1.2. Ыдыстар, инструменттер және материалдар

Қажетті химиялық ыдыстар эксперимент бағытына қарай анықталды. Жасушалар және ұлпалар культураларымен жұмыс істеу үшін қоректік орталарды дайындауға арналған ыдыстар қажет: өлшеу колбалары (0,05-3л), Эрленмейер колбасы (100-250мл), химиялық стақандар (0,05-1л), өлшеу цилиндірі (10-25мл), әр түрлі пипеткалар, бактерицидті және мембранды фильтрлер, Петри табақшалары (биік және төмен әр түрлі өлшемді), биологиялық пробиркалар.

Инструменттер. Әр түрлі ланценттер, пипеткалар (көз, хирургиялық, анатомиялық), қайшылар, скальпельдер, корсангтар, шпательдер, п репаровальд ы инелер, шприцтер, спиртовкалар.

Материалдар. Ыдыс және инструменттерді орауға арналған қағаз (орама, целлофанды, пергаментті), алюминий фольгасы, тығын және мақта тығындарын, ортаны сүзу үшін қалталарды жасауға арналған гидроскопиялық емес мақта.

Орталарды кеуіп кетуден сақтау үшін мақта тығындары мен целлофанмен жасалған қақпақ, полиэтиленді пленка қолданылады және оларды бекіту үшін резиналы сақиналарды пайдаланылады. Сонымен қатар халат, бас киім, резиналы перчатка, бахиллалар болуы тиіс.

Қажетті құралдар. Ламинар бокс (минимум 2-ден аз болмау керек, қажетісі 4), автоклав, центрифугалар және центрифужды пробиркалар, термостаттар, рН-метрлер, дистилляторлар, бидисциляторлар, электронды және аналитикалық таразылар, су моншалары, магнитті араластырғыштар, спектрофотометрлер, электрофорезге арналған құралдар, хромотографияға арналған құрал, электроплиткалар, кептіргіш шкафтар, мұздатқыш камералар, фотонасадкалар, инвертирлі, жарықтық, бинокулярлы микроскоптар, Горяев және Фукс-Розенталь камералары, вакуумдық насос, күндізгі жарық лампалары, культуральды бөлмеге арналған шыны стеллаждар, бактерицидті лампалар.

Автоклав қаныққан су буымен артық қысым әсерімен медициналық мақсаттағы металл, шыны, резина, текстильді материалдардан жасалған заттарды залалсыздандыруға арналған. Бұл заттарға будың әсері олардың функционалдық қасиеттерін өзгертпейді, сонымен қатар автоклавтар қоректік орта, биоматериалдарды утилизациялау үшін қолданады.

рН-метр. Бұл құралдың көмегімен дайындалған ортаның рН-ы әрі қарай жұмыста пайдалану үшін қажетті деңгейге дейін көтеруге немесе төмендетуге болады.

1.3. Жұмыстың асептикалық шарттары

Биотехнологиялық жұмыстардың ерекшелігі толық стерильдікті сақтау болып табылады. Сондықтан, биотехнологиялық лабораторияда жұмыс істеген кезде жұмыстың залалсыздығын қамтамасыз ететін және лаборатория ішінде жұғулардың пайда болуының алдын алатын келесі жұмыс ережелерін сақтау қажет.

1. Биотехнологиялық лаборатория бөлмесіне арнайы киімсіз, яғни халат, бас киімсіз кіруге болмайды.

2. Лабораторияға бөгде заттарды әкелуге болмайды.

3. Лаборатория бөлмесі күн сайын жұмыс алдында ылғалды жинау қажет. Үстел, құрал, құрылғы, сонымен қатар терезе алдындағы шаңды дезинфицирлеуші ерітіндімен ылғалдандырылған таза шүберекпен сүртеді. Еденді шаңнан шаңсорғыш арқылы тазартады, және содан соң 3-5% карбоксил қышқылының ерітіндісімен ылғалдырылған шүберекпен сүртіп алады.

4. Бокс бөлмесі келесі түрде өңделеді: күн сайын жұмыстың алдында еденді дезинфицирлеуші затпен (2% хлорамин ерітіндісі немесе 3% фенол ерітіндісі) сүртеді; ауаны еденнен 2-2,5 м биіктікте орналасқан бактерицидтік лампалармен залалсыздандырады, 1 лампа БУВ-30 (1,5-2,5 ВТ) 1 м³ орын есебіне көрсетілген жағдайда боксты 2-3 сағ. сәулелендіреді. Жұмысты бастау алдында лампаны сөндіреді. Бактерицидті лампа болмаған жағдайда жұмыс алдында бөлмелі 5% хлорамин ерітіндісімен сүрту арқылы боксты дезинфекциялайды.

5. Жұмыс алдында қолды және үстел бетін 80% спиртпен дезинфекциялайды. Инструменттерді қолданған сайын шам жалынында оларды алдын-ала абсолютті спиртке малып, күйдіру қажет. Күйдіру арқылы инструментті залалсыздандырғаннан кейін оны стерильді Петри табақшасына салады немесе залалсыздандырылған, «кітап» түрінде жиналған тығыз қағаз беттерінің арасына салады.

6. Культуральды ыдысты ашар алдында мойнының шетін күйдіру қажет және жабар алдында мойнының шеті мен тығынды күйдіреді.

1.4. Лабоаториялық ыдыс, инструменттер және материалдарды залалсыздандыру

Биотехнологиялық жұмыстарға арналған ыдыс таза, ал көптеген зерттеулерде стерильді болуы керек, себебі лас, дұрыс жуылмаған ыдысты пайдалану дұрыс нәтижелерді алуға кедергі жасайды. Біріншіден, ыдысты жуғыш заттармен жуады, құбырдағы сумен шаяды, кейін 2 рет дистелденген сумен шаяды. Бөлме температурасында кептіреді, содан кейін тығыз қағазбен орап, кептіргіш шкафта 160-180˚С 1,5-2 сағ бойы құрғақ ыстықпен залалсыздандырады.

Металл инструменттерін залалсыздандыру. Металл инструменттерді (қайшы, скальпельдер, пинцеттер және т.б.) өткірлігін жоймайтын және қақ басуын болдырмайтын 2 % натрий гидрокарбонат ерітіндісінде стерильдейді. Скальпель және қайшыны суға салудың алдыңда мақтамен ораған дұрыс.

Қағаз, марля және мақтаны залалсыздандыру. Мақта, марля, фильтр қағазын құрғақ ыстық пешінде 160˚С температурада термометрдің берілген температурасын көрсеткеннен кейін бір сағат немесе 1 атмосфера қысымда автоклавта залалсыздандырады.

Залалсыздандыру алдында қағаз және марляны бөлшектерге кеседі, мақтаны шар немесе тампон түрінде қажеттті көлемде орайды. Осыдан кейін материалдың әрбір түрін бірге немесе бөлек-бөлек тығыз қағазға орайды. Пакет жыртылып қалған жағдайда стерильденген материалды қайта залалсыздандыру қажет, себебі оның стерильдігі бұзылады.

Құрғақ ыстықпен стерилизациялау. Құрғақ ыстықпен залалсыздандыруды кептіргіш шкафта өткізеді. Залалсыздандыруға дайындалған материалды шкафтың қабырғасымен жанаспайтындай етіп қояды. Шкафты жабады және содан кейін есігін толық суығаннан кейін ашады, себебі ішке кіретін салқын ауа ыстық ыдыста жарық түсіруі мүмкін. Қысым астындағы бумен залалсыздандыру. Қысым астындағы бумен залалсыздандыру автоклавта өтеді. Автоклав, бір біріне кіргізілген 2 котелден, к ожуха және қақпақтан тұрады. Сыртқы котелді субулы камера, ал ішкісін - залалсыздандыру камерасы деп атайды. Субулы котелда будың түзілуі жүреді. Ішкі котелға залалсыздандырылатын материалды орналастырады. Залалсыздандыру котелінің жоғарғы бөлігінде кіші тесіктер бар, олар арқылы субулы камерадан бу өтеді. Автоклав қақпағы герметикалық кожуха жабылады.

Жоғарыда атап өткен негізгі бөліктерден басқа автоклавтың өзінің жұмысын реттейтін бірқатар детальдар бар: монометр, су өлшеуіш шыны, сақтандырушы клапан, шығару, әуе және конденсационды крандар. Монометр залалсыздандыру камерасында болатын қысымды анықтау үшін қызмет етеді. Қалыпты атмосфералық қысым (760 мм сынап бағанасы) ноль деп есептелінеді, сондықтан жұмыс істемей тұрған автоклавта манометр бағыты нольде тұрады. Манометр және температура арасындағы көрсеткіштерде белгілі бір тәуелділік бар:

Манометр көрсеткіші және судың қайнау

температурасынның қатынасы:

Манометр шкаласындағы қызыл сызық максималды жұмыс қысымын көрсетеді, яғни автоклавта осы мөлшерге дейін жұмыс істеуге болады. Сақтандырушы клапан шамадан тыс қысымнан сақтау үшін қолданылады. Оны берілген қысымда қондырады, яғни залалсыздандыру өткізілетін қысымда, манометр бағыты сызықтан асқан кезде клапан автоматтты түрде ашылып, артық буды шығарады, сол арқылы қысымның жоғарлауын төмендетеді.

Автоклавтың бүйір қабырғасында суды өлшейтін шыны бар, ол субулы котельде судың деңгейін көрсетеді. Суды өлшейтін шынының түтігінде екі горизонталь сызықтар көрсетілген – төменгі және жоғарғы, олар субулы камерадағы судың рұқсат етілетін төменгі және жоғарғы деңгейін белгілейді. Әуе краны залалсыздандыру және субулы камералардан залалсыздандыру алдында ауаны жоюға арналған, себебі ауа жылуды жәй өткізетін болғандықтан, залалсыздандыру режимін бұзады. Автоклав түбінде конденсация краны орналасады, ол залалсыздандыру камерасынан залалсыздандыратын материалды ысыту барысында пайда болатын конденсаттан босатуға арналған.

Автоклавпен жұмыс істеу ережелері. Жұмыс алдында автоклавты және бақылау-өлшеуші аппаратты тексеру керек.

Буды автоматты бақылау автоклавтарының субулы камерасындағы электро-вакуумды манометрдің бағыттары залалсыздандыру режиміне сәйкес орналастырылады: төменгі бағытты 0,1 атм төмен, ал жоғарғысын 0,1 атм жұмыс қысымнан жоғары қояды.

Субулы камерасын су өлшеуіш шынысының жоғарғы белгісіне дейін сумен толтырады. Су толтыру кезінде камераға бу берілетін құбырдың вентилін ашады, ол котельден ауаның бос шығуына мүмкіндік береді.

Автоклавтың залалсыздандыру камерасына залалсыздандырылатын материалды салады. Содан кейін ысыту көзін (электр тоғы, бу) қосады, бу көзін және залалсыздандыру камерасын қосатын құбыр вентилін жабады. Бу түзілу және субулы камерада қысымның пайда болуының басында субулы камераға продувка (залалсыздандыру котелынен ауаны жою) жүргізіледі. Ауаны жою тәсілі автоклав конструкциясымен анықталады. Басында ауа бөлек порциямен шығады, кейін түзу үздіксіз бу ағыны пайда болады, ол залалсыздандыру камерасынан ауаның толық шыққандығын көрсетеді. Ауаны жойғаннан кейін кранды жабады, залалсыздандыру камерасында біртіндеп қысымның жоғарлауы басталады.

Манометр бағыты берілген қысымды көрсеткеннен бастап залалсыздандыру басталды деп есептелінеді. Осыдан кейін ысыту интенсивтілігін азайтады, ол автоклавтағы қысымның қажетті уақытқа дейін бір деңгейде қалуына мүмкіндік береді.

Уақыттын аяқталуына қарай ысытуды тоқтатады. Залалсыздандыру камерасына бу беретін құбыр вентилін жабады және камерадағы қысымды төмендету үшін конденсационды камера вентилін ашады. Манометр бағытының нольге келіп түсуінен кейін автоклав есігін ашады.

Температура және залалсыздандыру ұзақтығы залалсыздандыратын материал немесе ондағы микроорганизмдер қасиеттеріне байланысты.

Мембранды фильтр көмегімен механикалық залалсыздандыру. Мембранды фильтрлер диаметрі 35 мм, қалыңдығы 0,1 мм болатын ақ түсті дисктер болып табылады. Олар нитрожасуның органикалық затынан жасалған. Мембранды фильтрлерді құрамында ысыту кезінде бұзылатын заттар бар қоректік орталарды залалсыздандыру үшін қолданады. Пайдаланар алдында мембранды фильтрлерді қайнату арқылы залалсыздандырады. Содан кейін стерильді ламинар бокста қоректік ортаны мембранды фильтрлі насадкасы бар пластмасса шприцтен өткізеді.

1.5. Өсімдік материалын залалсыздандыру.

In vitro – да жасуша және ұлпа культураларымен жұмыс істеудің негізгі шартты стерильдікті сақтау болып табылады. Өсіру объектісін залалсыздандыру алдында оны артық ұлпалардан тазартады, тамыр және тамыржемістерде қабығын, өркендерде қабықшасын, төбе бүршігінде беттік жапырақтарын және т.б. алып тастайды.

Бастапқы материалдарға байланысты оны залалсыздандыру әдісі таңдалынады. Химиялық заттардан стерилизация үшін келесі заттар көп қолданылады: құрамында активті хлоры бар (натрий немесе кальций гипохлориді, хлорамин), сулема (2 хлорлы сынап), сутегінің қос тотығы, этил спирті, бұдан басқа антибиотик, бромды су, күміс нитратын, диацид, белизнаны (1 кестеде) қолданады.

1 кесте

Бастапқы материалды залалсыздандыру (Р.Г.Бутенко бойынша, 1999)

Этил спиртін көбінесе материал бетін сүрту немесе материалды абсолют спиртке бірнеше минут салу арқылы алдын-ала залалсыздандыру үшін қолданады. Кейде мұндай залалсыздандыру жеткілікті және оны жеміс, тұқым, өркендермен жұмыс істегенде пайдаланылады.

Кальций гипохлориді (хлорлы әк) 5-7% ерітітнді түрінде 5-8 мин бойы гүл, тұқым, бүршіктеді өңдеу үшін қолданылады. Содан кейін екі-үш реттік дистиллденген сумен шаю жүргізіледі.

Натрий гипохлориді. 1 ден 20 мин дейін 0,5-5 % ерітіндімен өңдейді. Бұл зат жасуша уы болғандықтан, өсірілетін объектіні сумен жою алдында натрий гипохлоридінің қалдығын 0,01 н тұз қышқылымен жою қажет. Осыдан кейін 8 реттік дистиллденген сумен шаю жүргізіледі. Оқшауланған ұрықты натрийдің гипохлоритінің 2-3 % ерітіндісінде 5 мин.бойы, ал тозаңдарын 5-10 % ерітіндісінде 10-15 мин бойы алдын-ала этил спиртімен залалсыздандырады; ал құрғақ тұқымдарды 3-5 % ерітіндісінде 1 сағатқа дейін залалсыздандырады.

Хлорамин. 0,1-6% ерітінді конденсациясын тозаңқап және жас бүршіктер үшін 1-3 мин барысында өңдейді; құрғақ дәндер үшін өңдеу ұзақтығы бір сағатқа дейін созылады. Кейін стерильді дистиллденген сумен 3 рет шаяды. Құрамында активті хлоры бар ерітінділерді бір рет қолданады және оны тек қана жұмыс алдында жасайды.

Сулема – токсикалық зат және бөлек объектілер үшін концентрация таңдау және сақтау кезінде сақтылықты қажет етеді. Ұрықтар үшін 0,1 % концентрациясы қолданылады, өңдеу уақыты 1-3 мин, тамыр жемістер және түп-жемістер үшін 10-20 мин дейін.

Сутегінің қос тотығы. Көбінесе тұқымдарды залалсыздандыру үшін 2-30 % ерітінді түрінде 20 – 60 мин бойы қолданылады.

Антибиотиктер (10-80 мг/л стрептомицин немесе тетромицин, 200-400 мг/л ампицилин немесе нистатин) негізінен белгілі бактерия немесе саңырауқұлақтармен, мысалы, Agrobacterium tumefaciens коренчатый галл ұлпасындағы, инфицирленген материалдарды залалсыздандыру үшін пайдаланылады.

1.6. Қоректік орталарды дайындау технологиясы

1.6.1. Қоректік орталар құрамы

Өсімдіктер жасушалары мен ұлпаларының культурасын өсіруге арналған орталар компоненттерін 6 топқа бөлуге болады, бұл бастапқы концентрленген ерітінділерді сақтау және дайындау ретін көрсетеді. Бұл келесі топтар:

1) бейорганикалық қоректік заттар – макроэлементтер;

2) микроэлементтер;

3) темір көзі;

4) органикалық қоспалар (витаминдер);

5) көміртегі көзі;

6) органикалық қоспалар (өсімдіктің өсуінің реттегіштері). Оқшауланған жасушалар мен ұлпаларды көп компанентті қоректік орталарда өсіреді. Олар құрамы бойынша ерекшеленеді, бірақ, барлық, орталардың құрамына міндетті түрде өсімдікке қажетті микро- және макроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар және олардың синтетикалық аналогтары кіреді. Көмірсулар (әдетте бұл сахароза немесе глюкоза) 2-3% концентрацияда кез-келген қоректік қоспа құрамына кіреді. Олар қоректік компонет ретінде қажет, себебі көптеген каллус ұлпаларында хлоафилл болмағандықтан олар автотрофты қоректенуге қабілетсіз. Сондықтан оларды шашыраңқы жарықта немесе қараңғыда өсіреді. Тек мандрагор, амарант және кейбір басқа өсімдіктер каллустарын қалыпты жарықта өсіруге болады. Кейбір орталардың құрамы 2 кестеде көрсетілген.

2 кесте

Өсімдіктер жасушалары мен ұлпаларын өсіруге арналған кең қолданылатын орталар құрамы

1.6.2. Қоректік орталарды дайындау

Құрамына тәуелсіз орталарды дайындау ережелері бірдей. Өсіруге арналған орталарды дайындаудың ең қарарпайым әдістерідің бірі - бұл коммерциалық ұнтақ тәрізді орталарды қолдану. Оның құрамына бейорганикалық тұздар (макро- және микроэлементтер), витаминдер кіреді. Қажетті ұнтақ мөлшерін қағазда көрсетілгендей дистиллденген су көмегімен ерітеді. Содан кейін ерітіндіге сахароза, олар, фиотгормондар қосып, ортаны культуральды ыдыстарға құяды да, автоклавтайды. Қоректік орталарды дайындау үшін жоғары дәрежеде химиялық таза реактивтер қолдану қажет. Әдетте жұмысты тездету және жеңілдету үшін аса қанық ерітінділерді пайдаланады: макроэлементтер 10 есе концентрленген, микроэлементтер 100 есе. Макро- және микро тұздар ерітінділерін жазбаларға сәйкес дайындайды, бөлек өлшеп, дистиллденген және бидистиллденген суда еріту арқылы.

Макроэлементтерді Са және Fe тұздарынсыз дайындайды, олар тұнбаға түсетін болғандықтан, оларды бөлек қосады. Аса қанық ерітінділерді тоңазытқыштарда сақтайды. Сұйық орталарды дайындау үшін бір колбаға макротұздар және микротұздарды құяды, Са және Fe тұздарын, витаминдерді, фитогормондарды, сахарозаны қосады, рН мәнін қажетті мәнге келтіреді, ол үшін 1 н немесе 1 н Na OH қолданылады, содан кейін қажетті көлемге дейін келтіреді. Дайын орталарды колбаларға (көлемінің 10 %) құяды, қақпағымен жауып, залалсыздандырады.

Фитогормондар ерітінділерін келесі түрде дайындайды:

-ауксиндер: 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылы (2,4-Д), α-нафтилсірке қышқылы (НСҚ), β-индолилсірке қышқылы (ИСҚ), индолил қышқылы (ИМҚ), пиклорам – 100 мг затты 0,5-2 мл этонлода ерітеді, қыздырады, 100 мл дейін су қосады (концентрациясы 1мг/мл);

-цитокининдер: кинетин, зеатин, бензиламинопурин (БАП) – аз көлемде 0,5 н Н Cl ерітеді, қыздырады, сәйкес көлемде су қосады; абсциз қышқылы (АБҚ)- 70% этанолда ерітеді, қажетті көлемге су қосу арқылы жеткізеді, гибберилл қышқылы (ГҚ) – суда ерітеді;

-витаминдер: тиамин (В₁), пиридоксин (В₆), никотин қышқылы (РР), аскорбин қышқылы (С), фолий қышқылы (ВС), биотин (Н), парааминбензой қышқылы, холинхлорид, Са – пантотенат, цианкобаламин (В₁₂), рибофлавин (В₂) – суда ерітеді.

Барлық компоненттерді ортаға қосқаннан кейін керекті көлемге дейін су қосады, рН-н келтіреді. Автоклавтау арқылы залалсыздандырады. Құрамында ысыту кезінде бұзылатын заттары бар сұйық орталарды мембранды фильтрлер арқылы сүзу көмегімен залалсыздандырады. Қатты орта дайындау үшін дистиллденген су мөлшерінің жартысына агар қосады, содан кейін клеткада агар ерігенге дейін қыздырады. Кейін еріген агарға қажетті рН-ы бар ортаның барлық компоненттер ерітіндісін қосады, барлығын араластырып 2 қабат марля арқылы сүзеді, дистиллденген су арқылы қажетті көлемге жеткізеді, 20 мл-ден пробиркаларға, колбаларға (көлемінің 10 %) құяды, тығындармен жабады және залалсыздандырады.

1.6.3. Қоректік орталарды залалсыздандыру

Автоклавтау арқылы орталарды залалсыздандыруға қажетті минимальды уақыт колбадағы орта көлеміне байланысты. Мысалы, 250-500 мл көлем үшін автоклавтау 120 ºС-да 25-мин барысында жұреді. Өсімдіктер өсуінің кейбір регулятолары термобильді, сондықтан оларды автоклавтауға болмайды. Мұндай жағдайда, жоғарыда айтып өткендей, ортаны бұл заттарды қоспай дайындайды. Осыдан кейін колба салқындайды, содан кейін ғана ламинар – бокста қажетті рН – қа келтірілген, тесігінің диаметрі 0,45 мкм болатын мембранды фильтр арқылы сүзілегн термобильді компоненті бар ерітіндіні қосады. Кіші көлемді орталарды тұрмыстық тез пісіргішті пайдалану арқылы залалсыздандыруға болады. Орта бар термотұрақты ыдысты кострюля түбіне құйылған және матамен жабылған торға қояды. Залалсыздандыру уақыты 20 мин, осыдан кейін тез пісіргіш қалыпты қысымға дейін жай сууы тиіс. Кейін стерильді бокс жағдайында жылы ортаны культуральды ыдысқа құяды. Дайындалған орталарды 10 ºС температурада сақтаған жөн.

Бөлме температурасында ортада инфекция 5-10 күннен кейін пайда болады, егер дайындалған ортаның залалсыздығына күмәндансаңыз, ортасы бар бөлек культуральды ыдысты бақылаудан өткізген дұрыс.

In vitro культураларының әдістері.

2. Каллусты және суспензионды культураларды оқшаулау және ұстау

Өсімдіктердің оқшауланған жасушаларын және ұлпаларын in vitro жағдайында өсіру – организмнен тыс бөлек клеткалар мен ұлпалар бөлшегін, мүше немесе олардың бөліктерін көбейту және тіршілікке қабілеттілігін сақтау әдісі. Қазіргі кезде ол өсімдіктер генетикасы, цитологиясы және физиологияның көптеген фундаментальды сұрақтарын шешуге кең қолданылуда (1.2).

In vitro ұлпа культурасының барлық әдістемелері негізгі үш ережеге негізделген:

1) негізгі аналық өсімдіктен акспланттатты (жасуша, ұлпа бөлшегі, мүше) оқшаулау қажеттілігі. Бұл интактты өсімдікте болатын коррелятивті байланыстар және тәуелділіктен экспланттың босауына әкеледі.

2) Эксплантты бақыланатын, дұрыс таңдап алынған жағдайларға орналастыруға қажеттілік, себебі қоректік ортаның химиялық құрамы мен физикалық жағдайы өсірілетін ұлпалардың генотипикалық потенциал экспрессиясын тиімді реттейді.

3) өсірілетін материалдың стерильдігін сақтауға қажеттілігі.

Құрылғылар, реактивтер және материалдар

Құрылғылар: ламинарлы ауа ағынымен стерильді жұмыстарға арналған бокс; автоклав; рН-метр; инструменттер (пинцеттер, скальпельдер); лабораториялық ыдыс (шыны Петри табақшасы, колбалар, химиялық стақандар, өлшеуіш пипеткалар, пастер пипеткалары; бір рет қолданылатын Петри табақшасы); мембранды фильтрлер

Реактивтер: микро- және макротұздар, қанттар, фитогормондар, витаминдер, аминқышқылдар, антибиотиктер, агар; залалсыздандыру ерітінділері (диоцид, хлоракс, 70% этанол); стерильді дистиллденген су;

Материалдар: жапырақтар, өсімдіктер сабағы мен бүршіктері, тұқымдар; залалсыздандырылған жағдайда өсірілетін өсімдіктер.

Практикалық бөлім

2.1. Экспланттарды дайындау және залалсыздандыру

Ламинар бокста жұмыс істеу үшін алдын ала оны жұмысқа дайындау қажет. Бұл үшін 30 мин бойы ультракүлгінмен залалсыздандырады, осыдан кейін жұмыс беттерін 70-96% этанолмен сүртеді. Манипуляция жүргізуге негізгі талап – стерильді жағдайды сақтау, сондықтан жұмыс үшін алдын ала кептіргіш шкафта (2-2,5 сағ, 180-210ºС температурада) қыздырылған инструменттер мен ыдыстар болуы тиіс. Құрғақ ауа әдісінен басқа ыдысты 25 мин бойы 1-1,2 атм қысымда автоклавтау арқылы залалсыздандыруға болады. Жұмыс істер алдында инструментті этанолға салады және жұмыс беттерін спирт шамы жалынында күйдіреді.

Бастапқы өсімдік материалын залалсыздандыру келесі операциялардан тұрады:

- тұқымдар үшін 1-2 мин-қа, жапырақтар үшін 20 сек-қа 70% этанолға салу;

- тұқымдар үшін 15-20 мин, жапырақтар үшін 5 мин-қа диоцидке салу.

Диоцидті бөлек 330 мг этанолмеркурхлорид және 660 мг цетилпиридинилхлоридті ыстық суда ерітіп (шамамен 300 мл), алынған ерітіндіні араластырып және көлемін 1л-ге дейін жеткізіп, Твин-80 детергентінен бірнеше тамшы қосып дайындайды. Диоцидті тығыз жабылған колбада қараңғыда сақтайды.

Экспланттарды дезинфекциалаушы ерітіндіде ұстағаннан кейін оларды бірнеше рет дистиллденген суда жуады және скальпельмен сыртқы жасушалар қабығын алып тастайды, себебі ол залалсыздандыру кезінде зақымдалуы мүмкін.

Микроорганизмдер өсімдік ұлпасының ішінде де болуы мүмкін. Көбінесе ішкі инфицирлену тропикалық және субтропикалық өсімдіктерде кездеседі. Сондықтан беттік залалсыздандырудан басқа ұлпа ішіндегі микробты флораны өлтіретін антибиотиктер қолданады. Бірақ мұндай өңдеу ұлпаларды толығымен залалсыздандырмайтынын ескерген жөн, себебі антибиотиктердің бағытты әсерін таңдау қиынға соғады.

Өсімдік ұлпасының культурасын алу үшін далада, жылыжайда немесе стерильді жағдайда қоректік ортада залалсыздандырылған тұқымнан, меристемадан немесе өркендерден өсірілген өсімдіктің кез келген мүшесі қолданылады. Осы бөлімде өсімдік мүшесінен каллусты алу қарастырылады.

Егер каллус индукциясы үшін бастапқы материал ретінде стерильді емес өсімдіктер мүшелері алынса, онда оларды сабынды ерітіндіде шаяды, содан кейін калий перманганатының ерітіндісіне шайып, және боксқа апарады. 2-8 см болатын бөлшектерге кеседі, марлялы қапшықтарға салады, станқанда сулема, хлорамин немее диасид ерітіндісінде залалсыздандырады. Залалсыздандырудан кейін биологиялық материалы бар қапшықты стерильді дистиллденген суда үш бөліп шаяды. Эксплантты бөлу үшін залалсыздырылған тығыз қағаз (крафт) беттерінің арасында сақталынатын залалсыздандырылған инструменттерді пайдаланады. Қолданылған инструменттерді спирті бар стақанға салады да, спирт шамының жалынында күйдіреді, осыдан кейін қағаз беттерінің арасына салады, стерильді беттерінің әр бір қабаты тек қана бір рет пайдаланылады. Отырғызылған материалды әдетте қараңғы термостатқа қояды. 3-21 аптадан кейін кесілген бетте біріншілік каллус ұлпасы теріле бастайды.

2.2. Кaллус ұлпаларының индукциясы және сақталуы

Каллус - өсіру кезінде меристемалық жасуша, өткізгіш жүйе элементтерін, пигментті жасушалар ошағын түзетін ұйымдастырылған паренхималық жасушалардың пролиферациялық массасы.

Каллустық культуралар көптеген өсімдіктерде өндірістік жағдайда биопродуценттерді алу мақсатында, сонымен қатар бастапқы өсімдікті көбейту үшін-донор мен самоклональды алу үшін қолданылады.

Каллусты индуцирлеу үшін бастапқы залалсыздандырылған материалды 2-4 мм өлшемінде сегменттерге бөледі және оны пробирка немесе Петри табақшасындағы агарланған орта бетіне салады. Егер эксплант ретінде сабақ сегменті алынса, онда оларды ортаға апикальды жағынан орналастырады; астықтардың оқшауланған жас ұрықтарынан (10-14 күндік) каллус түзілу үшін ортаға қалқанынан жоғары қаратып салады. Егер мезокотиль, астық ұрығынан каллус алғысы келсе, оны қалқанын төмен қаратып ортаға салады. Сосудтарда жоғары ылғалдылықты сақтау үшін культуральды сосудтардың тығынын немесе қақпағын парафин немесе лейкопластырмен бекітеді.

Культуральды ыдыстардың тығынын және қақпағын ыдыста жоғары дәрежедегі ылғалдылықты сақтау үшін парафильм немесе лейкопластырмен бекітеді. Бірақ ыдыстың ішкі бетінде конденсатты болдырмау керек. Өсіру температурасы 22-28^оС. Каллустың түзілуі жарықта да, қараңғыда да өтуі мүмкін, кесілген бетте немесе барлық экспланттың бетінде 2-3 аптадан кейін түзілуі мүмкін. Каллус түзілгеннен кейін оны пассирлеу қажет, тез өсетін бөлімдерін таңдап алып, сол ортаға немесе басқа құрамды ортаға қайта отырғызу керек.

Қосжарнақтыларда эксплант ретінде каллус ұлпасын алу үшін тамыр, сабақ фрагменттерін, жапырақ паренхимасын, түп ұлпаларын, оқшауланған сабақ өзегін, гүл мүшесін, ұрықтарды, жеміс фрагменттерін пайдаланады. (1 сурет).

1сурет. Каллус культурасын әртүрлі экспланттардан алу: гүл мүшесінен, жапырақ, тамыр, сабақ бөліктерінен

3 кесте.

Каллус индукциясы үшін қолданылатын қоректік орталар

Жалаңаштұқымдыларда өскен бүршіктер, жас өркендер флоэма фрагменттері. Шөптесін өсімдіктерде каллус ұлпасын ұрықтардан, тамыр, сабақ кесінділері, жас гүлшоғыр, жас жапырақ, эндосперма ұлпасынан алады (3 кесте).

Каллусогенезді сақтау үшін оның индукциясына қарағанда ауксин концентрациясы аз мөлшерде қажет.

Үрмебұршақ каллусын оқшауланған түбіршек шеттерінен алу әдістемесі. Бұл әдіс бұршақ тұқымдастарының каллус культурасын алуға ыңғайлы.

1. Тұқымды диаметрі 8,5 см болатын Петри табақшасына (1табақшаға15 түйірден) салады.

2. Табақшаға тұқым бетін жабатындай етіп натрий хлориды ерітіндісін (1-1,4% активті хлор - бұл сатылатын концентрленген ерітіндінің 10 еселік сұйытылуы) құяды. Ерітіндіні 20 мин қояды.

3. Петри табақшасында тұқымдарды үш рет стерильді сумен (20 мл-ден) шаяды.

4. Тұқымды Петри табақшасындағы стерильді дистельденген суда түнге ісіндіру үшін қалдырады.

5. Содан кейін тұқымды натрий гипохлоридімен 20 мин залалсыздандырады.

6. Тұқымды үш рет дистиллденген стерильді сумен шаяды (20 мл)

7. Оларды жаңа стерильді Петри табақшасына ауыстырады (табақшаға 5 түйірден).

8. Тамыр ұштарын оқшаулайды (2-3 мм) және оларды стерильді дистиллденген суы бар Петри табақшасына ауыстырады.

9. Кейін каллустың индукциясы үшін тамыр ұштары ортаға ауыстырады. (Шенк және Хильдебрандт ортасында 5 шеттері табақшаға.) Табақшаларды парафильммен бекітеді де, өсіру температурасы 25^оС болатын термостатқа ауыстырады.

Картоп жапырағы және сабағынан каллус алу әдістемесі

Картоп түрі және сорттарының жапырақтары мен сабағы экспланттарынан каллус түзу индукциясы құрамында 3-5 мг/л 2,4 –Д және 0,3-1мг/л кинетин (6) бар МС ортасын қолданумен жүреді. Кейбір жағдайларда каллус түзілу құрамына 5 мг/л 2,4-Д МС ортасында немесе 0,2 мг/л БАП, 0,2 мг/л НСҚ және 1мг/л 2,4-Д Мс ортасында, немесе 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л л НСҚ, 0,5 мг/л НСҚ және 0,2 мг/л кинетин бар В5 (5) ортасында жүреді. Каллус ұлпасын құрамында аз мөлшерде 2,4-Д, көбінесе НСҚ бар орталарда ұзақ пассирлеу жүргізіледі. Картофель ұлпасынан каллус өсіруге (пассирлеу) арналған қоректік орталардың құрамы 4 кестеде келтірілген. Бірақ әрбір жағдайда ол біріншіден өсу регуляторының конйентрациясы және құрамына сәйкес эмпирикалық түрде таңдап алынады.

4 кесте

Картоптың каллус ұлпасын пассирлеу және индукциялауға арналған орта құрамы (мг/л)

Ескерту: орта рн 5,7- 5,8

Картоп каллус ұлпаларын қараңғы климаттық камерада немесе стандартты жағдайларда (қараңғылық температура +25+26^оС, ауаның салыстырмалы ылғалдығы 80-90%) термостатта өсіреді.

2.3. Каллустық культураларды пассирлеу (субкультивирлеу)

Агарланған ортада пассирленген каллус культурасын алу үшін экспланттан біріншілік каллус ұлпасын алады және Петри табақшасына салады. Қажетті каллус ұлпасын 200-300мг бойынша бірдей бөліктерге бөледі де, пробиркадағы немесе Петри табақшасындағы агарланған орта бетіне салады. Мұндай процедураны өсу жылдамдығына байланысты 4-6 аптадан кейін қайталайды. Әдетте өсу циклі 4 аптаға тең, бұл уақытта жақсы өсетін каллус штамдары ішкі салмағын 10 есе үлкейтеді.

Қатты қоректік ортада өсірілетін өсу процестерінің динамикасын анықтау үшін өлшенген бөлшектерді отырғызу жүргізіледі. Оны Петри табақшасына ішіне салмағы 100-110 мг келетін каллустың 5 бөлігін сала отырып жасаған ыңғайлы. Өлшеуді стерильді түрде таразыда өткізеді. 3-4 Петри табақшасы статистикалық өңдеу үшін жетеді. Өсіру циклінде 4-5 нүктедегі салмағын анықтау қажет, яғне өсу қисығын алу үшін бір өсіру циклінде максимум 20 табақша болу керек. Әрбір табақшада 100-150 мг-нан 5 бөлшек болу тиіс. 3 аптадан кейін каллусты өлшеу қажет. Салмағынан басқа каллус ұлпасының консистенциясын, түсін ескеру қажет. Өсу жылдамдығын өсу индексінің мәні (ӨИ) бойынша анықтайды, ол мына формула бойынша есептелінеді:

ӨИ ═ W_1─ W₀

W₀

Мұнда W₁ - каллустың бастапқы массасы,

W₀ - өсіру циклінің соңындағы каллустың массасы.

Поиск по сайту: