Гаплоидты клетка культуралары

Гаплоидтар - бұл құрамында жарты (гаметадағыдай), бірақ соматикалық емес хромосомалар жиыны бар өсімдік.

In vitro жағдайында тозаңның микроспораларын өсіру гаплоидты өсімдіктер мен гаплоидты каллусты ұлпаларды алуға мүмкіншілік береді. Андрогенез атты бұндай құбылыс генетика мен селекцияда үлкен қызығушылық тудырады, өйткені гаплоидтар бағалы мутацияларды анықтап және бөліп алу жеңіл болады, ал колхицин көмегімен in vitro жағдайында гомозиготты диплоидты өсімдіктерді алу мүмкін болады. Гаметаларды түзумен бағдарланған тозаң дәндері in vitro-да өсірудің шарттарымен байланысты бөлшектеп вегетативті клеткаға сай процестерге көшеді. Осы қассиеттерге байланысты тозаң мен тозаңқап культуралары физиологиялық және биохимиялық зерттеулерде қолданылады.

Тозаңқаптардан гаплоидты ұлпаларды алу және өсінділердің гаплоидты регенерациясы туралы алғаш рет Гуха және Магешвари айтқан болатын (10). Кейінгі дамуын, бұл әдісті Нича анықтаған (11), олар көп мөлшерде темекі гаплоидты өсімдіктерін алған. Қазіргі уақытта бұндай экспериментальды бағыт ғылымдардың көңілін аударып және фундаментальды зерттеулер үшін де, көптеген ауыл шаруашылық культураларын жақсарту мақсатында да қолданып жүр.

Тозаңқаптарды өсіру әдісі

Тозаңқап культурасының әдісін қазір 23 тұқымдас пен 52 туысқа жататын өсімдіктердің 153 түрінен гаплоидтарды алу үшін көп қолданады. Әдістің кең дамуы үшін модельді объектілер болып Solonaceae тұқымдас ының дурман және темекі сияқты түрлері есептеледі.

Құрал-жабдықтар, реактивтер және материалдар

Құрал-жабдық: ауаның ламинарлы ағынымен стерильдеу үшін бокс, автоклав, рН-метр, Carl Zeiss Jena микроскопы, объектив х20, х40, саймандар (пинцеттер, скальпель), лабораториялық ыдыстар: (шыны Петри табақшалары, колбалар, химиялық стақандар, өлшеу пипеткалары, пастер пипеткалары; 1реттік қолдануға арналған Петри табақшалары), мембранды фильтрлер, заттық және жабын әйнектер.

Реактивтер: микро-және макротұздар, қант, фитогормондар, витаминдер, амин қышқылдар, агар; стерильдейтін ерітінділер (диоцид, 70% этанол), 2% ацетокармин ерітіндісі, колхицин, стерильді дистильденген су.

Материалдар: түсті гүл бүршіктері, масақтар, тозаңқаптар, гүл шоғыры.

Практикалық бөлім

Андрогенездің индуцирленуі әсіресе культураға енгізген кезіндегі тозаңның жағдайына байланысты болып келеді. Тозаңның гаплоидты ұлпасын алу үшін культураны 1-ші митоз кезінде енгізу ұсынылады. Кейбір өсімдіктердің гаплоидтарын алу кезінде (соның ішінде дәндер мен Brassica түрлері) матералдың салқын өңделуі қолданылады. Бұндай мақсатпен Brassica-ң гүл бүршігін 10^оС-да 2-28 күн аралығында; ал кесілген масақтарын дәндер түрлеріне байланысты 4-7С-да 3-тен 20 күнге дейін ұстайды. Гүл бүршігін мен масақтарын эксплантация алдында 0,1-5% хлорлы кальцииімен 5-15 минут бойы стерильдейді. Культураға енгізу үшін құрамында бір клеткалы микроспоралары бар гүл бүршіктері, әлі ашылмаған тозаңқаптар қолданылады. Бұл үшін қажетті:

1) Микроспораларды 2% ацетокарминмен бояп, микроскоппен тозаңқаптардағы тозаңның стадиясын анықтау қажет. Құрамында бір клеткалы микроспоралы тозаңқаптары бар бүршіктерді теріп алу.

2) Гүл бүршіктерін бөліп алып, диоцид ерітіндісінде стерильдеп, 3 реттік стерильді дистильденген сумен шаю керек. Пинцет көмегімен бүршіктің бір жағынан кесінді жасап, стерильді Петри табақшаларына аталықтарды жинап алу қажет. Тозаңқаптарды Нича ортасына отырғызады. Кейін культураны 24-27^оС температурада инкубирлейді және 14/10 сағ. фотопериодымен шамамен 2000 лк жарықпен экспонирлейді. Тозаңқаптар культурасында тозаңнаң өскіншелердің түзілуі үшін 3-8 апта қажет. Оқшауланған тозаңқаптарды өсіру үшін кеңінен 3 ортаны қолданады. Уайт ортасы-Ephedra, Ginga, Taxus, Torreya, Lolium, Hordeum тозаңдары үшін; Мурасиге мен Скуг (6) орталары-темекі тозаңқаптары үшін және Нича мен Нич ортасы (11) - Datura, Brassica тозаңдары үшін.

6 кесте

Тозаңқаптар мен тозаңдарды өсіру үшін Нич ортасы

Колхицирлеу. Гибридті және гаплоидты өсімдіктерді колхицинмен өңдеуді хромосоманың қос жиының қалпына келтіру үшін және фертильді формасын, яғни амфиплоидты гибридтер мен гомозиготты диплоидтарды алу үшін өткізеді:

1) 2-3 жапырақтар фазасына дейін оқшауланған ұрықтан дамыған өсімдіктері бар пробиркаларды 8-10^оС түнгі температурасымен колхицирлеуге 7 күн қалғанда камераға орналастырады.

2) Өсімдіктер пробиркаларына 0,5% колхицин мен 4% ДМСО құяды, сосын микроанаэростатқа (МИ-752 моделі) құяды, мұнда ауа 20 минут бойы 76 мм рт.ст. қалдық қысымға дейін сорылады, осыдан кейін ауаны баяу енгізумен қалыпты қысым орнатылады. Процедура 3 рет қайталанады.

3) Колхицирлеуден кейін түнгі-15^оС және күндізгі 22^оС температура кезінде өсімдіктерді топырағы бар ыдысқа отырғызады. Өсімдікті отырғызғаннан кейін 6 күн бойы гиббереллин (2мг/л), кинетин (0,5 мг/л) мен никотинамид (3 мг/л) ерітіндісімен жапырақтарына себіп, тамырдан тыс қоректендіруді өткізеді.

Цитогенетикалық анализді регенерант-өсімдіктері мен гаплоидтардың санын анықтау мақсатында өткізеді.

Каллусты ұлпаны Карнуа қоспасында (сірке қышқылы: этил спирті көлемі бойынша 1:3) өсірудің бастапқы 7-10 күннен кейін бекітеді. Бекіту уақыты- бір сағаттан тәулікке дейін. Бекітілген материалда метафазды пластинкаларындағы хромосомалардың санауын жүргізеді және анафаза мен телофазадағы хромосомалардың ерекшеліктерін талқылайды.

Кейбір заттардың әрекеті метафазды пластинкалардың жинақталуына және бөліну фазасының бұзылуы мен тежелуіне әкеледі. Бұндай мақсатпен 2-4 сағ. бойы 0,025-0,1% концентрациядағы колхицин ерітіндісімен бекіткенге дейін материалды қайта өңдеуден өткізеді. Кейін материалды Карнуа қоспасында бекітеді және қышқылдың иісі кеткенше дейін 70% спиртпен шаяды және 70% спирт ерітіндісінде сақтайды. Препараттарды дайындау үшін сірке қышқылында орсеин немесе кармин ерітінділерінде бояйды. Бұған ұқсас жолмен хромосомалар санының анализі үшін өсімдіктерде түпшелерін бекітеді. Фольген немесе ацетокармин бойынша түпшелердің ұштарын бояйды.

Ацетокарминді дайындау. Су моншасына орнатылған кері тозаңытқышы бар колбаны қолдана отырып, 55мл. дистильденген су мен 45мл. мұздай сірке қышқылында 1г. карминді ерітеді. Бұндай процедура 30 минуттен 60 минутқа дейінгі уақытты алады. Содан кейін ерітінді суығанда, оны сүзіп, тығыны бар ыдысқа қояды.

Ацетоорсеинді дайындау. 1г орсеинді 45 мл сірке қышқылында ерітеді және суығаннан кейін 55 мл дистильденген суды қосады. Ерітіндіні шайқап, сүзеді.

Бояу әдістемесі. Каллусты ұлпалардың бөлшектерімен түпшелердің ұштарын бояу үшін алдын ала бірнеше рет жеңіл қайнатқаннан кейін, бірнеше минут немесе сағатқа бояғышқа орналастырады. Сосын бояу объектісін 45% сірке қышқылының тамшысы бар заттық шыныға қояды да, жабын шынымен, сосын фильтрлі қағазбен жабады және ұлпалардың біркелкі басылуы мен клеткалардың шашыраңқы орналасуы үшін үстінен ұрып қояды.

Тозаңды өсіру әдістемес

Жеке микроспораларды өсіру мен тозаңның соматикалық ұлпаларын бөліп алу теориялық мүмкіншілігіне қарамастан, мұндай әдісті тек жеке өсімдіктер түрлеріне мысалы, Datura, Petura, Nicotiana, Brassica қолдануға болады.

Тозаңды соматикалық клеткалардан бөліп алудың түрлі әдістері бар.

Спонтанды босатылуы. Инкубирлеу шарттарын, алдын ала өңдеуді және тозаңның даму кезеңдерін дұрыс табатын болсақ, онда көптеген түрлердің тозаңқаптары сұйық ортада өсіру кезінде ашылады да, тозаң беткі қабатқа шығады. Бұндай «тозаң культурасының» пассивті түзілісін Solonaceae, Brassica-ң көптеген түрлері мен астықтұқымдастың кейбір түрлерінен алуға болады.

Гомогенизация мен фильтрлеу

Бұндай әдісті тек алқа тұқымдастарға, рапсқа және қант қызылшасына ғана табысты қолдануға болады. Темекі суспензиясын алу үшін құрамында шамамен 1 мл-де 5 х 10⁴ дәні бар (1 мл-де 1 тозаң бар) алдын ала өңделген тозаңдарды 3-4 күн ішінде өсіріп мұқият сұйық ортада ыдыратады (6 кестеге қара). Сосын суспензияны сүзеді (тесіктер өлшемі 50-100 мкм меш) және 5 мин. бойы 5g центрифугадан өткізеді. Тұнба үстіндегі сұйықты жояды, тозаңды шаяды және 1мл-де 5*10⁴ тығыздығымен Петри табақшасында сұйық ортада суспендирлейді. Сосын жоғарыда сипатталғандай инкубирлейді.

3. Протопластарды өсіру мен оқшаулау. Метоболизм ингибиторларына төзімділікті көтеру үшін клеткалық селекция іске асыру

Өсімдіктердің протопластары тұтас өсімдік пен олардың клеткаларының генетикалық модификациясы үшін қолданылатын көптеген әдістемелердің негізгі нүктесі болып табылады (14). Оқшауланған протопластарды құйылыстыру, оларға бөтен ДНҚ-ны енгізу үшін және липосомалар, түрлі молекулалар және т.б. органеллалардың қатысуымен трансформация үшін қолданады.

Протопластар-энергия трансформациясы мен биосинтезді орындауға, белсенді метаболизмді іске асыруға қабілетті және толық құрылымдылығымен сипатталатын клеткаішілік органоидтары бар, мембранамен шектелген цитоплазмалық құрылымдар (17,20).

«Протопласт-клетка-толық өсімдік» жүйесі өсімдіктердің генетикалық реконструкциясы үшін анағұрлым ыңғайлы жүйе болып табылады. Олар Solanaceae туысымен жасалған көптеген жұмыстармен нақтыланған.

Протопластарды өсіру мен оқшаулау техникасы темекі, картоп, томат, люцерна (26), беде (41), цикорий, мия, қант қызылшасы, баклажан, қауын, ағаш культуралары (47), орамжапырақ (43), көп клеткалы шөптер (22,46), соя (48) сияқты өсімдіктер үшін өндірілген.

Бұршақ пен астықтұқымдастылар протопластарын бөліп алу үшін қойылатын талаптарды таңдап алу қиынға соғады. Қазіргі уақытта жоғары сатыдағы өсімдіктер (27) 31 тұқымдасы, 36 туыс, 212 түрінің протопластарынан регенерацияланған. Жоғары сатыдағы өсімдіктердің оқшауланған өсімдіктері биохимия, физиология, өсімдіктер генетикасында, вирусология мен басқа аймақтарда (35) кең қолданылуда. Өсімдіктердің генетикалық (гендік) инженериясы үшін, субклеткалық бөлшектерді тасымалдау бойынша зерттеулерде, өсімдіктердің соматикалық гибридизациясында оларды қолдану ерекше маңыздылыққа ие болады.

3.1. Протопластарды бөліп алу мен өсіру әдістері

Оқшауланған протопластардың физиологиялық жағдайы бөліп алу үшін қолданылатын өсімдіктерді өсіру шарттарымен анықталады. Өсу температурасын, ылғалдылықты, жапырақтандыруды, ортаның қоректік заттармен байытылуы, өсіру уақытты, патогендермен зақымдалуының жоқтылығын ескеру қажет.

Суспензия үшін клеткалық қабырғалар жұқа болып тұрған кезінде оның экспоненциальды өсудің фазасын тұрақты ұстап тұру қажет. Тұқымдарды өсіру үшін оны мұқият стерильдеп, ассептикалық жағдайда өсіру қажет.

Бөлінетін протопластардың сапасы мен олардың мөлшері көптеген факторларға байланысты: типі (жапырақ, ұрық, тамыр, клеткалық суспензия), өсімдік түрі мен ерітіндінің сорты, өсімдіктің физиологиялық жағдайы, рН═5,4-6,2, ферментті ерітінді, жарықтандыру (көп жағдайда оқшаулану қараңғыда немесе әлсіз жарықта өтеді), температура (бидай үшін + 14^оC, томат үшін +27^оC), ферменттерде инкубация уақытты, осматикалық стабилизатордың типі мен концентрациясы, түрлі протекторлардың қолданылуы (18, 21, 25).

Ең алғаш рет протопластар 1892 жылы плазмолизді зерттеумен байланысты Клеркоммен бөлініп алынған болатын. Бұндайда клеткалық қабырғаларын жоюдың механикалық әдісі қолданылған (35). Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алудың жақсы бір әдісі- энзиматикалық, ол аз уақытта зақымдалмаған протопластардың анағұрлым көп мөлшерін алуға мүмкіндік береді.

Клеткалардың қабырғаларын бұзатын негізгі компоненттер, пектинозалар, целлюлазалар сияқты ферментативті препараттардың 3 типі қолданылады.

Ферментті препараттардың комбинациясы мен олардың қатынасы клеткалардың әрбір типіне тәуелді болады.

Протопластарды бөліп алу үшін оптимальды шарттар түрлі ұлпаларға өте индивидуальды, олар эмпирикалық таңдалып алынады. Ферменттердің қажетті құрамын, олардың концентрациясын, қатынасын, өңдеу уақытын анықтайды.

Осмотиктің концентрациясы мен типі маңызды фактор болып табылады. Осмотиктерді – ионогенді емес – қант (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит) және ионогенділерге – тұздар (KCL, CaCL₂, Na₂HPO₄) деп бөледі.

Протопластардың жеңіл плазмолизденген болғандағы бөліну көзіне байланысты осмотиктің концентрациясы 0,3-тен 0,8 мольге дейін ауытқиды.

Протопластардың тұрақтылығына клетканың мембранды жүйесіне әсер ететін жоғары CaCL₂, MgCL₂, қатысады. Оқшауланған протопластарды ферментті ерітінділермен бір және 2 деңгейлі өңдеу жолымен алады. Бірінші кезеңде мацерозиммен өңдеумен кейінгі интактті клеткаларды, ал екіншісінде-«жалаңаш» протопластар алынады. Целлюлаза мен пектиназа қолданылатын бір деңгейлі энзиматикалық өңдеу әдісі өзінің қарапайымдылығымен аса кең таралған.

Кейбір жағдайларда материалды алдын ала плазмолитик ерітіндісінде инкубирлейді (преплазмолиз).

Протопластарды алу үшін негізгі фактордың бірі жақсы аэрация болып табылады (17,18). Түрлі факторларға байланысты инкубация уақыты 1-2-н 15-16 сағатқа дейін ауытқиды.

Энзиматикалық изоляциядан кейін протопластар бұзылмаған ұлпалардан тазартылады және ферменттерден шайылады. Бұл үшін фильтрация техникасын қолданады, яғни центрифугалау мен флотация.

Протопластарды өсіру мен бөліп алу схемасы

Жапырақтардан протопластарды бөліп алу әдістемесі (мысалы темекі)

Құрылғылар, реактивтер мен материалдар

Құрылғылар: ламинар бокс, үстел центрифугасы, инвертирленген микроскоп, Горяев немесе Фукс-Розенталь камерасы, пробиркалар үшін штатив, Петри табақшалары (диаметрі 6 см мен 10 см), Эрленмейер колбалары (50 мл), пастер пипеткалары, шыны сүзгілері мен нейлон фильтрлері бар колбалар (сүзгіде тесіктердің диаметрі шамамен 60 мкм), өлшегіш пипеткалар немесе 1 мл және 10 мл ұштықтар, 10 мл-ге центрифужды пробиркалар, «Millipore» мембранды фильтрлер,тесіктердің диаметрі 0,2 мкм немесе 0,4мкм болатын «Millipore» фильтрлер үшін саптамалы шприц, пинцеттер, скальпельдер немесе ұстағыштағы жүздер.

Реактивтер: Driselase («Sigma, США») немесе 0,8% Cellulisin, 0,4% Macerase («Calbiochim», АҚШ) құрамында 0,5 М сахароза және 50 мМ CaCI₂, рН 5,5-5,8 ерітіндіде дайындалған 0,5% стерильді ферменттік ерітінділер, W-5; K-3, W-S-S стерильді орталар; антиметаболиттердің стерильді ерітінділері; 5 мМ аминоэтилцистеин ерітіндісі.

Материалдар: темекінің, картоптың, бидайдың өскіндерінің, жүгерінің асептикалық өсімдіктері, бидай мен күріштің суспензиондық культуралары.

Практикалық бөлім

Ферментті ерітінділерді дайындау мен жапырақ мезофилінің ферментациясы

Ферментті ерітінділерді тікелей тәжірибе алдында немесе тәулік қалғанда дайындау қажет. Ерімейтін бөлшектерді тұндыру үшін 10-15 мин бойы 2 мың айн/мин кезде мақсатқа сай центрифугадан өткізеді. рН-н жеткізгеннен кейін ерітінділерді саптамалы шприц көмегімен «Millipore» сүзгі арқылы колбаларды фильтрлейді (әр біреуіне 7-10 мл). Ферментация үшін темекінің жас жапырақтарын қолданады. Стерильді табақшаның бетіне тасымалданғаннан кейін жапырақтарды скальпель (лезвия) көмегімен жіңішке сызықтарға кеседі, содан кейін оларды ферментті ерітіндінің бетіне орналастырады. 10 мл ферментті ерітіндіде ферментация үшін жапырақ ұлпасының 1 г жеткілікті. Ферментацияны 15-18 сағат бойы 28-30^оС температурада термостатта өткізеді.

Протопластарды өсіру мен бөліп алу

Ферментациядан кейін колбаның құрамын нейлон фильтрімен сүзгі арқылы бос колбаға фильтрлейді. Жапырақ ұлпаларының қалдықтары фильтрде, ал оқшауланған протопластар колбада қалады. Олардың суспензиясы центрифугаға арналған пробиркаға тасымалданады және 1 мың айн/мин кезде 3 минут бойы центрифугадан өткізеді. Өмірге қабілетті протопластар бетке шығады да, оларды пастер пипеткасымен оңай жинап алуға және W-5 ортасымен жартылай толтырылған пробиркаға ауыстыруға мүмкін болады. 700 айн/мин кезінде 1-2 мин бойы осы ортада центрифугалай отырып, протопластарды тұндырамыз, бұндай жолмен ферментті ерітіндінің қалдықтарынан шая аламыз. Шаюды әдетте 2 рет орындайды. Протопластар қалдықтарын К-3 ортасының (0,5мл) кішігірім мөлшерінде (темекі жағдайында) (7 табл) немесе W-S-S ортасында (картоп үшін) ресуспендейді, одан кейін 6-10мл идентивті ортасы бар (диаметрі 6-10см) Петри табақшасына байқап құяды. Себілген протопластардың оптимальды тығыздығы шамамен 1милилитрге 10³ клеткалар. Тығыздық Горяев немесе Фукс-Розенталь камерасы көмегімен анықталады. Протопластарды өсіру шашыраңқы жарықта немесе 26-28^оС температурада термостатта өтеді. Протопластардың сапасы мен олардың бөліну бақылауы инвертті микроскоп көмегімен анықталады.

7 кестеде Nicotiana және басқа да алқа тұқымдастар қатарындағы өсімдіктердің протопластарын өсіру үшін орта, сонымен қатар олардың құйылысу өнімдері (мг/л).

Бидай мен күріштің суспензиялы культурасынан протопластарды бөліп алу әдістемесі

Берілген әдістеме ертеде өңделген және М. А. Айтхожин атындағы МБжБИ клеткалық инженерия лабораториясында Джардемалиев Ж.К және оның әріптестерімен табысты жүзеге асты.

Клеткалық суспензияны 5-6 миллилитр мөлшерінде клеткалар өсірілген колбадан центрифужды пробиркаға стерильді көшіреді де, 150 g кезде 5 минут бойы центрифугирлейді (пробирканы стерильді фольгамен жабады). Алынған тұнбаны құрамында 2,0% Cellulase TS, RS (SERVA), 0,5% Driselase (SERVA),0,1% Pectaliase Y-23 (SERVA) бар ферментті ерітіндімен араластырады, шайқайды және пастер пипетканың көмегімен Петри табақшаларына ауыстырады, оны мықтап жауып, 26^оC температурада 4-5 сағатқа термостатқа қояды. Ферментативті ерітіндіні центрифугалаумен тазалайды (500g, 15минут) және шприцтің көмегімен стерильдейді (0,22 мкм). Клеткалық суспензияның 5-6 миллиметріне ферментативті ерітіндінің 12 миллиметрін енгізеді. Бұндай әдістеме тіршілікке қабілетті протопластардың 45-50%-н алуға мүмкіндік береді.

Оқшауланғаннан кейін протопластарды W-5 жуғыш ерітіндімен тазалайды. Бұл үшін алынған протопластар суспензиясын ұлпа қалдықтарымен бірге тесіктері 100 бен 50 мкм өлшеудегі металлды електер арқылы сүзеді және фильтратқа соңғы 30-40 миллилитр көлемге дейін W-5 құяды да, стақанда тұну үшін қалдырылады.

Осыдан кейін стақандағы бар құрамды 3 центрифужды пробиркаға құяды да, 150 g 5 минут бойы центрифугирлейжі. Супернатант алынып тасталады, флотация үшін тұнбаға сахароза ерітіндісінің 2 миллилитрін қосады да (0,5 м сахароза және 5 мМ CaCI₂xH₂O), араластырып 3 пробиркадағы құрамды біреуіне құяды, және үстінен тығыздық градиенті түзілу үшін 1,5 миллилитр W-5 қосады. Центрифугалау кезінде (200 g, 3 минут) протопластар орта бөлімдерінің беткі қабатына шығады (флотациядан өтеді). Бөлшектер және бұзылмаған клеткалар тұнбаға түседі. Протопластар пастер пипеткасымен таңдап алынады да, басқа пробиркаға ауыстырылады, мұнда оған W-5 ерітіндісінің 12 миллилитрін құйып, сахарозаны шаю үшін 5 минут 150 g центрифугалайды. Алынған тұнбаға B-5 Гамборгер B-5 қоректік модифицирленген ортасының 1,5-2 миллилитрін қосып араластырады және стерильді Петри табақшасына (диаметрі 2,5см) ауыстырылады. Табақша парафилльммен жабылады да 25^оС температурада термостатта өсіріледі. Клеткалар бөлінген жағдайында қоректік ортаны апта сайын жаңартады және өсіру кезінде клеткалар көлемінің орта көлеміне белгілі бір қатынасын бірқалыпты жағдайда ұстап тұрады.

Бидай мен жүгері жапырақтарының мезофилінен протопластарды бөліп алу әдістемесі

Бидай мен жүгерінің өсінділерін тұқымнан бөліп алып, ұсақтайды және преплазмолиз үшін келесідей ерітіндіге салынады: CaCI₂х2H₂O - 1480,0 мг/л тұз қоспасындағы 0,8 М глицерин; MgS₄х7H₂O - 246,0 мг/л; KH₂PO₄ - 27,2 мг/л және 0,4 M сахароза. Преплазмолизді нәзік мезофильді ұлпасына ферменттердің бұзу әсерін әлсірету үшін қолданады. Осының нәтижесінде плазмолемма клеткалық қабырғалардың энзимдердің әсерінен еру кезінде аз зақымдалып, протопласт плазмолиз кезінде клетка мембранасынан алшақтайды.

Бөліп алу шарттары схема бойынша өткізіледі:

1. Ферменттердің оптимальды концентрациясы мен әсер етудің минимальды уақытын анықтау. 1%-н 2%-ға дейінгі концентрациядағы Cellulase TS, RS (SERVA), 0,025%-н 0,1%-ға дейінгі концентрацияда Pectate Lyase (SERVA) сияқты ферменттер қолданылады. Ферменттер жоғары сипатталған әдістеме бойынша дайындалады. Мезофильді протопластар үшін құрамында тұз бен антиоксиданттары бар күрделірек ортаны қолданады (20,21).

2. Осмотиктің оптимальды концентрациясын анықтау. Осмотиктердің 2 типі қолданылады: 0,2М; 0,3М; 0,4М концентрацияда ионогенді KCL және 0,4-0,9М концентрациядағы ионогенді емес глицерин мен манит.

Каллус пен жапырақтардан (мысалы картоптың) протопластарды бөліп алу әдістемесі

Поиск по сайту: