 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Органогенез
|
Читайте также: |
Ұлпалар культурасындағы органогенез бүтін өсімдікке дейін дамитын өркендер түзілу немесе тамыр тәрізді жарықта жасылданатын және бүтін өсімдікті регенерациялауға қабілетсіз болатын құрылымдар түзілу жолымен жүреді.
Өсімдікті органогенез арқылы 3 әдіспен алуға болады:
1) Экспланттан алынған каллус бетінде қосалқы мүшелердің түзілу жолымен (мысалы, темекіде)
2) Каллус түзілмей экспланттан бірден қосалқы органдардың түзілуі арқылы.
3) Қолтықтық бүршіктерден түзілетін өркендерден регенерант-өсімдіктердің түзілуі жолымен.
Темекі органогенез арқылы өсімдіктер регенерациясының модельді жүйесі болып табылады. Қоректік орталарда өсу реттеушілері концентрациясын өзгерте отырып, өркендерді тура экспланттан немесе аралық каллусогенез арқылы өсіруге болады. Бұл үшін, әдетте, культиверлеу ортасындағы ауксин концентрациясы төмен болу керек.
6-сурет. Темекі мысалындағы өсімдіктердің регенерациялану әдістері.
6.2.1. Каллустан өркендердің түзілуі.
Каллуста de novo сабақтық примордиялар және кейін өсімдіктерге дейін дамитын соматикалық эмбриоидтар түзілуі мүмкін. Тұтас өсімдік және өркендер қалыптасуымен дифференсациялана алатын каллустүзілуіне әр түрлі экспланттарды қолданады.
Шөптесін өсімдіктер экспланттарын сабақтардан, жапырақтардан, гүлдің күлте жапырақшаларынан алуға болады. Көпжылдық өсімдіктерден морфогенді каллусттарды алу үшін клеткалары митотикалық активті болатын мүшелерді қолданады, мысалы, өркендер төбесі немесе олардан бөлінген меристемалық ұлпа фрагменттері.
Каллустың қасиеті оны индукциялауға алынған материалдың тегімен, каллустың жасымен, оның пассирлеу жиілігіне тәуелді болатын күйімен анықталады.
Практикалық аспектте каллус ұлпасының алынуы көп өскіндер алу үшін қолданатын өһркендердің өсуінің индуцирлеуімен байланысты. Бұл лабораториялық жағдайларда өсімдіктерді, соның ішінде табиғатта мұндай тәсілмен көбеймейтін түрлерлді, вегетативті көбейтудің бір әдісі.
Шөптесін өсімдіктер каллусынан өркендерді алу әдістемесі:
1) Өсімдіктерді жылы жайларда өсіреді. Өсімдік гүлденге дейін экспланттарды жапырақтардан бөліп алады. Жапырақтарды күн шығуынан 2 сағат өткен соң немесе бұған дейін қараңғыда болған өсімдіктерден жинап алу керек.
2) Жапырақтарды сабынды сумен жуады, кейін сумен шаяды, 70%-к этил спиртіне салады, қайтадан залалсыздандырылған дистильденген сумен шаяды.
3) Жапырақтар бетін 1,1%-к натрийдің гипохлориді ерітіндісінде 20 минут ішінде шеңберлі качалкада шайқай отырып стерильдейді. Жапырақтарды үш рет стерильді дистильденген сумен шаяды.
4) Жапырақтарды скальпель және пинцет көмегімен 1-2 см өлшемдегі бөлшектерге турайды да, құрамында 1 мг/л 2,4-Д бар Мурасиге және Скуг ортасына тасымалдайды.
5) 25-29°С және 16 сағсттық жарық күнде (1000 люкс жарықтану) культиверлейді. Бірнеше апталардан соң каллус түзіледі.
6) Каллус бөлшектерін құрамында өркендердің қалыптасуына қажетті 0,22 мг/л БАП бар агарланған МС ортасына пассирлейді.
7) Сол жағдайларда культиверлеу. Өркендер 3-6 аптадан соң түзіледі.
8) Өркендерді бөлшектеп құрамында фитогормондары жоқ агарланған МС ортасына отырғызады.
9) Сол жағдайлардағы культиверлеу, тек жарықтандыру 5000 лк.
10) Тамырланған өсімдіктерді топыраққа отырғ,ызады.
6.2.3. Өсімдіктердің культиверленуші экспланттардан тікелей регенерациялануы.
Бұл әдіс әсіресе шөптесін өсімдіктердің жапырақтарын, пиязшықтарын, пиязшық түйнектерін, сабақтарын, тамырсабақтарын және түйнектерін пайдаланғанда жарамды келеді. Эксплантты ауксин мен цитокининнің шамалы мөлшері бар қоректік ортаға отырғызады, осыдан кейін одан өркендер түзіледі. Көбейту өркендер шоғырындағы өркендерді бір-бірінен ажыратып, әрқайсысын жеке ыдысқа отырғызу арқылы жүзеге асырылады.
Бегониядан тура органогенез жолымен өсімдік-регенеранттарды алу әдістемесі.
1) Жылы жайларда өсірілген өсімдіктерден жас толық ашылған жапырақтарды кесіп алады.
2) Жапырақтарды 5,25% натрийдің гипохлориді ерітіндісінде, 10 минут ішінде залалсыздандырады. Стерильді дистильденген суда 3 рет шаяды.
3) Жапырақтарды ұзындығы 5 мм болатын бөлшектерге бөледі, БАП-0,4 мг/л, НУК-0,1 мг/л бар агарланған МС ортасының бетіне отырғызады.
4) 25-29°С-те, 16 сағаттық фотопериодта және 1000 лк жарықтандыруда культиверлейді. Қосалқы өркендер тура экспланттан апталардан соң түзіледі.
5) Әр культураны бөледі және 4 аптадан соң сол ортаға көшіреді. Бұл үрдісті өсімдіктердің қажетті санын алғанша қайталайды.
6) Өркендерді агарланған МС орталарына көшіре тамырландырады. Бұл ортаның құрамында 0,1 мг/л НУК болады.
7) Тамырланған өркендерді топыраққа көшіреді.
6.2.4. Қолтық бүршіктерден түзілетін өркендерден өсімдіктердің регенерациясы.
Жүзім мысалындағы in vitro вегетативті көбею жүзім өркендрін қолтық бүршікпен ұзындығы 3-5 мм болатын бөлшектерге бөліп, қоректік ортасы бар пробиркаға немесе колбаға орналастырады. Бактериальді зақымдалуды басу үшін культиверлудің бірінші кезеңінде қоректік орталар құрамына антибиотиктерді (мысалы, карбенициллинді) қосуға болады. Антибиотки ерітіндісін алдын-ала ммбранды фильтрден стерильдейді де 38-40°С-ке дейін сұйытылған қоректік ортаны қосады.
Түзілген өркендерді бөлшектеу әдісімен көбейтуге болады және гормонсыз орталарда немесе НУК-ң төмен концентрациясы бар (01-0,2 мг/л) оррталарда өсіруге болады.
Культиверлеуді жаррықта 25-26°С температурасында жүргізеді. Бөлшектер тамырланып 3-4 аптадан соң өркендер береді.
Жылдамдатылған микрокөбейту келесі кезеңдерден тұрады:
1) Адвентивті бүршіктердің пролиферациясын индукциялау.
Сабақ апекстерін Эрленмейер колбаларына Мурасиге және Скуг, Уайт сұйық ортасына немесе БАП-ң жоғары мөлшері бар амборг (5,6) ортасына орналастырады да 2-3 апта ұстайды. Әдетте бұл уақыт апкальді доминантылықты жоюға жеткілікті болады. Адвентивті бүршіктердің интенсивті пролиферациясы басталады.
2) Өркендердің түзілуі.
2-3 аптадан соң экспланттарды құрамында БАП-ң төмен мөлшері (2 мл) бар сұйық қоректік ортаға көшіреді. Бұл ортада 1,5-2 аптадан соң өркендердің түзілуі басталады.
Қалыптасқан өркендерді пролиерлеуші экспланттардан бөліп алады да ауксиннің төмен концентрациясы бар ортаға көшіреді.
In vitro қолтықтық өркендердің түзілуі.
Барлық өсімдіктер олардың төбелік (апикальдік) меристемаларының белсенділігі арқасында өседі. Апикальді меристемаға 0,1 мм-ден 0,3 мм-лік, 1 немесе 2 жапырақтық примордиялары бар өркен ұшындағы ұлпа жатады. Төбелік меристемаға және оған жанасқан өркен ұшына тән тотипотенттілік көптеген өсімдіктер түрлерін өндірістік клональді көбейтудің неізі болып табылады. Культиверленген меристмалық ұлпалар қолтықтық бүршіктер арқылы өсімдіктерді реенерацялай алады (7-сурет).
7-сурет. In vitro жағдайында картоптың меристема ұлпасын культверлеу және қолтықты бүршіктердің өсіп шығуы.
Картоп түйнектерін далалық жағдайларда өсірілген өсімдіктерден алады(1,2). Түйнекті 2,5 см-лік бөлшектере бөледі, ГК-мен өңдейді де, фитогормондары жоқ ортаға ауыстырады (4). Бір ай ішінде өркендер өседі және қосалқы тамырлар шығады (5). Өркендерді 0,01 мг/л НУК бар ортаға көшіреді, қолтықты бүршіктер түзіледі (6). Жақсы дамыған өркндері мен тамырлары бар өсімдіктер-регенеранттарды топыраққа ауыстыруға болады (1) немесе 0,1-0,2 мг/л БАП бар ортаға ауыстыра отырып, минитүйнектердің түзілуін қамтамасыз етуге болады (7).
Мұндай әдіспен алынған өсімдіктер әдетте аналық өсімдіктің генотипін сақтап қалады. Бастапқы экспланттың өлшеміне байланысты, бұл әдіс көмегімен, патогендерден тәуелсіз өсімдіктерді алуға болады.
Қолтықтық бүршіктер культуральді төбешіктерден немесе түйіндер сегменттерінен дами алады.
Эксплантты әдетте қолтықтық бүршіктерден өркендердің стимульдеу және каллус түзілуіне бөгет жасау үшін, ауксин мен цитокининнің төмен концентрациялары бар орталарға орналастырады.
Solanum tuberosum картобының түйнектерінен культиверленетін меристемалық ұлпаларды пайдаланып, залалсыздандырылған микротүйнектер мен регенеранттарды алу әдістемесі.
1) Картоп түйнектерін 2 см2 шамасындағы бүршігі бар бөлшектерге кеседі. Экспланттарды ұйқыдағы бүршіктерді ояту үшін, гиббереллин қышқылының (ГК) ерітіндісіне 1 г/л 1 сағатқа салып қояды, кейін залалсыздандырылған ылғалды вермикулит бетіне термостатқа отырғызады. Өркендер ұзындығы 5 см болғанда, олардың төбелерін алып тастайды.
2) Төбешіктерден меристемаларды микроскоп арқылы 20-40 есе үлкейте отырып, 0,2-0,5 мм өлшемеде бір примордиялы жапырақшамен бөліп алады және агарланған МС ортасының бетіне әр түрлі фитогормондармен орналастырады.
3) Культиверлеуде 25°С температурасында, 1500 лк-тік жарықта және 12 сағаттық күнде 30 тәулік өткізеді, кейін 500 лк-тік жарығы бар камераға тағы да 30 тәулікке көшіреді. Бұл перриодтың аяғында өркендер 3 см ұзындығына жетеді.
4) Өркендерді құрамында НУК- 0,01 мг/л бар агарланған МС ортасының бетін көшіреді. 20 күннен соң олардан 2-3 қосалқы тамырлары бар қолтық өркендр дамиды.
5) Өркендер санын көбйту үшін, барлық үдерісті оларды көшірумен әр 20 күн қайталайды.
6) Өркендер 10 см-ге жеткенде оларды қосалқы тамырлармен топыраққа отырғызады.
7) Қолтық өркендерді құрамында 1,2 мг/л БАП және 80 г/л сахарозасы бар агарланған МС ортасының бетіне 500 мл көлемді ыдысқа көшіреді.
8) 18-30°С, 8 сағаттық жарық күнінде, 1000-5000 лк жарықта культиверлейді.
9) 4 айдан соң әр пробиркада жаңа төбелік өркендер көзі бола алатын 30-50 микротүйнектер дамиды.
10-таблица. In vitro жағдайда микрробөлшектеу және түйнек түзілуіне қолданатын қоректік орталар құрамы.
Сұйық қоректік орта (В-1) бөлшектеуге де, in vitro культурада түйнек түзілуіне де ыңғайлы және экономикалық жағынан тиімділігі болып табылады. (10-таблица).
Картоптың көптеген сорттарының in vitro жағдайындағы жылдамдатылған түйнек түзілуіне ыңғайлы болатын ота – құрамында сахарозасы көп және 1 мг/л концентрацияда БАП пен кинетин бар орта (В-3). Егер БАП концентрациясын 2 мг/л-ге дейін көтеріп, кинетинді сол қалпында калдырсақ (В-2), микротүйнектердің түзілуі иниберленеді (8-суррет).
8-сурет. Картопты in vitro микротүйнектерден көбейту және сауықтыру.
6.2.5. Меристемді өсімдіктердің микроклональді көбеюі.
Микроклональді көбею үрдісін бірнеше кезеңдерге бөлуге болады: (9-сурет)
1-кезең. Донор өсімдігін таңдап алу, эксплантты залалсыздандыу және оған қоректік ортада in vitro өсуге жағдай жасау.
2-кезең. Көбею жолдары: а) каллусты және суспензиялық культура арқылы көбею. б) жапырақ ұлпалары, сабақ ұлпалары, түйнектің қабығы мен түбі, тамыршалармен, каллус ұлпаларын түзбей, адвентативті бүршіктердің түзілуін индукциялау. в) химиялық әдісі және өркендерді микрокескіндеу кезіндегі апикальді доминанттылықты басу нәтижесінде экспланттың барлық қолтық бүршіктерінің дамуын стимуляциялау.
3-кезең. Көбейіп жатқан өркендерді тамырландыру және оларды сақтау (депонирлеу). Тамыр жүйесінің дұрыс дамуын қамтамасыз ету керек. Бұл үшін қоректік ортаға ризогенді фактор – ауксинді қосады. Тамырлар түзілген соң өсімдіктерді топыраққа отырғызуға дайындайды немесе төменгі температурада сақтауға орналастырады (депонирлеу). Бұл өсімдіктердің дамуын тоқтатады және оларды ұзақ уақыт сақтауға, керек кезінде қолдануға өсімдіктердің in vitro жағдайына адаптациялануына мүмкіндік береді.
4-кезең. Культуральды ыдыстардан алынған өсімдіктерді жылы жай жағдайларында топырақта өсіру. Реализацияға және далаға отырғызуға дайындалу.
Микроклональді көбейтуді және сауықтыруды картоп, алма, құлпынай, қарақат, жүзім және көптеген гүл тұқымдастарында жүргізеді.
Сауықтырылған регенерант өсімдіктерді көбейту үшін алғаш рет Г.М.Винклер және Р.Г.Бутенко ұсынған микробөлшектеу әдістемесін қолданады.
Микробөлшектеуді фитогормондардың әр түрлі концентрациясы (кинетин -0,25-1 мг/л, НУК – 1мг/л, НУК- 3 мг/л) және сахарозасы (1-4%) бар МС ортасында жүргізеді. Бұл үшін қолданылатын сұйық және қатты қоректік орталардың құрамы 10-таблицада берілген.
Жабық рунт жағдайында отырғызу алдында пробркалық өсімдіктерді құрамында 1,5% сахароза және 2 мг/л 2 НУК бар қоректік ортада культиверлейді.
Бұл әдісті вируссыз материалды алу үшін, өсімдіктерді клональді көбейту мақсатымен морфогенез ерекшелілігін зерттегенде пайдаланылады.
Соңғы жағдайда культиверлеуді химио және термотерапиямен ұштастырады.
Апикальді меристемаларды бөлшектеу бойынша, өсімдіктерді микробөлшектеу жұмыстарын ламинар боксте асептикалық жағдайда бинокулярлы лупа астында, 10 еселік үлкейткмен өтеді.
9-сурет. Микроклональді көбейту кезеңдері.
Картоптың апикальді меристмаларын бөліп алу және культиверлеу әдістемесі.
Вирустық аурулармен күресудің негізгі жолы – сау отырғызылатын материалдарды алу. Соңғы кездері картоптың вируссыз түрлерін және т.б. вегетативті көбейетін культураларды алу үшін, апикальді меристемалар культурасы әдістемсін термоөңдеу, хемотрапия және әр түрлі вирустарға тестілеу әдісін қолдпнуда (10-сурет).
Апикальді меристемалар культурасының әдістемесі әдеттегі өсімдіктерді вирустардан тазарту әдістерінен ерекшеленеді, өйткені, сау регенерантты өсімдіктерді стерильді жағдайда культиверлеу қайтара инфекциялануды болдырмайды. Апекстерді сау өсімдіктерді алу үшін қолдану негізі – П.Лимассе мен П.Корнуе эксперименттері. Олар 1949 жылы темекі жапырақтарындағы темекі мозайкасы вирустарының концентрациясы төбеге жақындаған сайын азайатынын байқаған. Өркендер ұштарының жартысында немесе апикальді меристемаларда вирус табылған.
Вегетативті көбейетін культураларды вирустық аурулардан сауықтыру үшін, практикада апикальді меристема әдісін қолдану 1952 жылы Г.Морель және К.Мартин жұмыстарының арқасында басталды. Олар бұл әдісті георгинді мозайка вирусынан сауықтыру үшін қолданады.
1. стерильді өсімдіктерді алу үшін түйнектерді алдын-ала 10-35 күн ішінде қараңғыда өсіреді.
2. этильденеген өскіндерді сегменттерге кеседі, 20 минут ішінде, кейін 3 рет стерильді дистильденген суда жуады.
3. меристмаларды 20-40 рет үлкейтетін микроскоп астында 0,2-0,5 мм мөлшерде бір примордиялық жапырақшамен бөліп алады да, МС қоректік ортасына меристема өсу үшін әр түрлі фитогормондарды қоса отырғызады.
4. өсімдіктерді МС, Уайт және В5 ортасында өркендер түзілу үшін цитокининдермен, температура 23-25°С-да фитотронда және 8000 люкс жарықтандырумен 16 сағаттық фотопериодта – 1 күн, 8 сағат – 1 түн, салыстырмалы ылғалдылық 75-80%.
11-кесте. Картоп меристемаларының культиверленуіне арналған қоректік орталар құрамы.
6.3. Протопластардан өсімдіктердің регенерацялануы.
Протопластарды олардан инактивті өсімдіктер регенерацияланумен сәтті культверлеу алғаш рет 1971 жылы Такебемен жүзге асқан. Тіршілікке қабілетті протопластарды культиверлеу барысында, олар клетка қабығын регенерациялап in vitro культиверлнетін әдеттегі клеткаларға айналады. Целлюлозаның алдыңғы заттары және пектинді заттар негізінен гольджи аппаратында синтезделеді, бірақ бұл үрдіс басқа да клеткалық құрылымдарда, мысалы, эндоплазмалық торда ядрро бақылауымен өтуі мүмкін. Кейде ядросыз протопластар бөлінеді, оларды цитопластар деп атайды. Цитопластар жаңа клетка қабықшасының регенерациясына қабілетсіз.
Протопластарды алу үшін қолданылған ферменттерді шайып тастаған соң, клетка қабықшасы 10-20 минуттан кейін бірден түзілуі жүретінін, ал 20 сағ олар қалың тор түзетінін электронды мкроскопия көрсетті. Клетка қабығы мен плазмолемма арасындағы байланыстардың бұзылуы бірден клтка қабығының репарация механзмін іске қосады деуге болады. Инактивті клетка қабығын сақтап қалған плазмолизденген протопластың бетінд де жаңа қабықтың репарацялану факты өте қызықты. Репарация үрдісінің жылдамдығы мен ерекшлілігі алдыңғы жасушаның түрі мен дифференсацясына байланысты.
Крестгүлділер, пасленді, зонтты тұқымджастарының протопластары клетка қабығын 24 сағатта түзеді. 24-36 сағаттан соң алғашқы клетка бөлінулрі байқалады. Осылардың салдарынан 3-4 аптадан соң каллусты клеткалар коллониясы түзіледі. Культверлеу процесі барысында бөліну жылдамдығын жылдамдату үшін, осмостық қысымды біртіндеп төмендтеді (2 аптадан соң). Сұйық ортадағы протопластар культурасын осмостық қысымы төмендетілген ортамен араластырады. Кейін каллустарды өсімдіктер регенерациясы үшін агарланған ортаға көшіреді. Каллустағы мофогенез индукциясы регенерант өсімдіктер түзілуіне әкеліп соғады.
11-сурет. Протопластардан өсімдіктердің регенерациялануы, культиверленуі және шығарылуының схемасы.
Өсімдіктер ргенерациясы эмбриоидогенез арқылы жүзеге асуы мүмкін. Соматикалық эмбриоидогенез сәбіздің суспензялық культурасынан алынған протопластар культурасында және сәбіздің тамырынан бөлнген протопластарда, картоп, томат, темекі, дәрілік спаржа, люцернаның протопластар культурасында байқалады. (12-сурет).
Оқшауланған протопластардан қайта түзілен клеткалардың бөлінуге және тотпотенттілікке қабілтті көптген факторларға тәуелді:
1. түрлік ерекшелік, физиолоиялық күйінде, протопласт алынған ұлпаның дифференсация күйіне, демек, оның генетикалық және эпигнетикалық сипаттамасына.
2. протопластарды бөліп алу әдістемесі мен жағдайлары.
3. протопластарды отырғызу тығыздығы.
4. қоректік ортаның құрамы.
5. культиверлеу жағдайлары.
Протопластардан түзілген клеткалардың пролиферативті қабілеттілігін анықтайтын бұл факторлар тізімінде протопластардан алынған өсімдіктердің генетикалық және эпигенетикалық сипаттамалары бірінші орынды алады.
12-сурет. Сәбіз протопластарының культурасында өсімдіктердің түзілуі және эмбриоидогенез.
А- сәбіз клеткалар культурасынан алынған протопластар.
Б- клетка қабығының түзілуінен кейінгі протопластар.
В- сәбіз протопластынан түзілген 3-4 апталық эмбриоидтар.
Г- сәбіз өсімдіктері (H.Gramhow et al., 1972.D.Dudits e al., 1976).
Көптеген ауыл шаруашылық маңызы бар өсімдіктерден реенерацияға қабілетті, жақсы өсетін протопластардан алу әлі мүмкін емес. Бұл өсімдіктердегі клетканың пролиферацияны және клеткалық дифференсацияны анықтайтын факторлар белгісіз. Темекіде және т.б. алқа тұқымдастарының өкілдерінің (картоп, томат) протопластарынан өсімдіктер оңай, ал астық және бұршақ тұқымдастарынан алу шешілмеген мәселе болып қала беруде. Өсімдіктердің протопластарынан регенерациялануы жоғарыда аталған әдістердің ең қиыны. Протопластардан регенерация сәтті өтетін өсімдіктер – бұл сәбіз, темекі, рапс, картоп, апельсин және томат.
Картоп протопластарын бөліп алу және өсімдіктер регенерациясының әдістмесі.
Протопластарды бөліп алу.
1) Асептикалық жағдайда өсірілген өсімдіктер жапырақтарын 1-2 мм-лік жіңішке кесінділерге бөліп, ферментті ерітіндіе салады:
а) 1%-к Cillulysin, +0,5% Macerase және 0,5 м сахаоза 5 мМ Cacl2, pH 5.6
б) 0,5%-к Driselase, 0.5 M сахароза және 5 мМ CaCl2, pH 5.6
в) 14-16 сағат 28°С температурасында инкубациялайды.
Протопластарды тазарту.
2) Ферменттік ерітінді инкубациялаудан кейін протопластарды нейлон тор арқылы фильтрлейді (ұяшықтар өлшемі 60-100 мкм), өткізуші жүйе элементтері мен қорытылмай қалған ұлпа бөлшектерінен арылу үшін.
3) Протопластар суспензиясын 150g 2-3 минут центрифугерлейді.
4) Ерітінді бетінде жүріп жүрген протопластарды пастер пипеткасымен абайлап тереді де, центрифужді пробиркаға салады.
5) Протопластар суспензиясына 0,5-1,0 мл араластыру кезінде келесі құрылымдағы 8-10 мл тұз ортасын W-5 қосады: 0,9 % NaCl, 1,84% CaCl2 , 0,08% KCl және 0,1% глюкоза, pH – 5,7 және 3 минут 80-100g-да центрифугерлейді. Тұнба үстіндегі сұйықтықты алып тастайды. Үрдісті екі рет қайталайды.
Протопластарды культиверлеу.
6) Қоймалжын W-5 ортасындағы протопластар суспензиясының 2-3 тамшысын 2-3 мл W-S-S (8-кесте) ортасы құйыллған Петри тостағаншасына (60х15 мм) ауыстырады.
7) Әр 6-10 күн сайын клеткалар суспензиясына жаңа қорекктік ортаны қосады, клеткалардың белгілі бөлігін қоректік ортамен басқа Петри табақшаларына ауыстырады.
8) Алынған микроколлонияларды ST-1 агарланған ортаға балқытады. Бұл үшін 1-2 мл клеткалар суспензиясын Петри тостағаншасына (100х20 мм) ауыстырады да, біртіндеп шеңбер бойымен араластыра отырып, тостағаншада 15-25 коллониялар алу мақсатымен, 10-15 мл жылы (40-45°С) агарланған ортаны қосады. Петри тостағаншасына қосатын балқытылған ортаны агардың соңғы концентрациясы 0,7% шамасында болғандай етіп дайындайды. Культиверлеуді жарықта (4-5 ккилолюкс, 16 сағаттық фотопериодта) 24°С-де жүргізеді.
9) 10-12 күннен кейін жеке коллонияларды агардан алып қайтадан сол орта (ST-1) бетіне отырғызуға болады. Мұндай культиверлеу жағдайларында коллония ашық-жасыл реңді болады.
Өсімдіктер регенерациясы.
10) Морфогенез индукциясы үшін диаметрі 1-3 мм болып түзілгеен тығыз каллусты ұлпаларды ST-2 ортасына көшіреді және 24°С, 16 сағаттық фотопериодта, 4-5 килолюкс жарықталуда 25-30 күн культиверлейді. Әдетте өсімдіктер регенерациясы үшін коллонияларды жаңа ST-2 ортасына қайта отырғызу керек.
11) Биіктігі 3-10 мм болатын өркендерді каллус ұлпасынан тамырландыру үшін ST-3 гормонсыз ортаға көшіреді. (12-кесте)
12) Картопты жерге өсімшелер ретінде жиі отырғызады, ал кейде in vitro индуцирленген түйнектер ретінде отырғызады.
Әдебиеттер
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.- М.: Наука, 1962.-272 с.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений.-Киев: Наукова думка, 1980.- 488 с.
3. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых.-Киев: Наукова думка, 1985. -132с.
4. Experimtnt in Plant Tissue Culture / End. J.H. Dodds, L.W. Robert.-London; Camdridge University Press, 1985.- 121p.
5. Gamdorg O. L., Miller R. A., Ojima K. Nutrient requiremtnts of suspension cultures of soubean root cells. – Exp. Cell Res., 1968, p.79-82.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culcures // Physiol. Plant. – 1962. – Vol. 15. – P. 473-497.
7. Howard H.W. Genetics of the potato Solanum tuberosum. London: Logos Press. - 1970.
8. Джардемалиев Ж.К., Карабаев М.К., Никифорова И.Д., Бутенко Р.Г., Айтхожин М.А Исследование роста клеточных популяций различных видов пшеницы и эгилопса в суспензионной культуре.- Вестник АН Каз ССР, 1988, №8, с.66-71
9. Бутенко Р.Г. Выращивание клеток высших растений в суспензионной культуре. – Известия АН СССР, 1977, №, с.697-709
10. Guha S., Maheshwari S. C. In vitro production of embrios from anthers of Datura // Nature.- 1964.-V. 204, N 4957.-P. 497. 87.
11. Nitsh J.P., Nitsh C. Haploid plants from pollen grains // Science. - 1969.- V. 163, N 3862.-P. 85-
12. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений.- К.: Наукова Думка, 1984-160с.
13. Murashige T. Plant propagation throgh tissue culture // Ann. Rev. Plant Phisiol. – 1974. – Vol. 25. – P. 135-166.
14. Игнатова А.К. Особенности выделения и некоторые свойства изолированных протопластов листьев клевера лугового.- Физиология растений АН СССР, 1990,т. 37, вып.2, с. 372-378.
15. Dix P.H. Cell line selection // Plant Cell Culture Technology.- London: Oxford Press, 1986.- H. 143-201.
16. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension culture of soybeen root cells.-Exp.Cell Res., 1986, v.5, p. 151-158
17. Сахно Л.А., Скаржинская М.В. Регенерация растений из изолированных протопластов Brassica.- Физиология растений АН СССР, 1990,т. 37, вып.1,с.188-193
18. Hideki Jaton, Norihiko Misava, Kamji Ohyama, Tohru Komano. Protoplast isolation from soybeen and wheat cell suspension culture and soybeen- wheat intergeneric fusion.- Memoris of the College of Agriculture,- Kyoto University, 1983,№ 121b, h.35-41
19. Kao K.M., Michayluk M.R. Nuritional requirements for grouth of Vicia hajas tana cell and protoplast at a very low population density in liquid media.- Planta, 1975, v. 126, 105-110
20.Джардемалиев Ж.К. Биотехнологические аспекты регенерации растений в культуре клеток и протопластов пшеницы. Канд. дис-Алматы 1994-223с.
21. Maddock S.E Suspension and protoplast culture of hexaploid wheat (Triticum aestivum).- Plant Cell Rep.,1987, v6, p 23-26
22. Kao K.M., Michayluk M.R. Nuritional requirements for grouth of Vicia hajas tana cell and protoplast at a very low population density in liquid media.- Planta, 1975, v. 126, 105-110
23. Глеба Ю.Ю. Сытник К.М, Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений. – Киев: Наумова Думка, 198140с.
24. Глеба Ю.Ю. Бутенко Р.Г. Сытник К.М, Слияние протопластов и парасексуальная гибридизация у N. tabacum,-ДАН СССР, 1975, т221, 5с. 1196-1198.
25. Melchers G., Sacristane M.D. Somatic hybridisatian of plants by fusion of protoplast.// The chromosome number of somatic hybrid plants of four different fusion experiments. - In: La culture des tissues et des cellules des vegetaux. Paris: Masson, 1977, p 169-177/
26. Smits H.H., Kao K.M., Combati N.C. Interspecific hybridisatian by protoplast fusion on Nicotiana. - J.Hered., 1976, v.67.p.123-128
27. Gleba Yu.Yu., Hoffman F. Plant-genome engineering by protoplast fusion. - Naturwissenchaften, 1979, v. 66.
28. Hoffmane F., Adachi T. Chromosomale recombination and morfogenesis in asymmetric intergeric hybrid cells.- Planta, 1981, v. 153, p.586-593
29. Парасексуальные цитоплазматические гибриды (цибриды) полученные слиянием протопластов. - ДАН СССР 1978 т.240 №5 с. 1223-1226.
30. Глеба Ю.Ю., Мяшкене И.В. Гибридизация соматических клеток и возможность анализа и манипуляций с гнами цитоплазмы высших растений.- Биополимеры и клетка, 1986, т. 2 №1, с. 5-11
31. Chetrit P., Mathieu C., Vedal F., Pelletier G., Primard C. Mitochondrial DNA polumorphism induced by protoplast fusion i Cruciferae.- Theor.and apll. Genet, 1985, v64, №4, p.361-366
32. Medquesi P., Feges E., Maliga P. Intespecific chloroplast recombination in Nicotiana somatic hybrids.- Proc. Acad. Sci. USA, v.82, p. 6960-6964
33. Бутенко Р.Г., Кучко А.А. Получение межвидового соматического гибрида картофеля методом слияния изолированных протопластов.- ДАН СССР. 1979, т247, с 491-495
34. Бутенко Р.Г. Биотехнология растений: Культуры клеток. М: Агропромиздат. 1989. - 280с.
35. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин., А.Ф.,Коржевская Т.Г., Маркова Е.Н. Клеточная инженерия.- М.:ВШ, 1987-128с.
36. Сидоров В.А. Биотехнология растений: Клеточная селекция. – Киев Наукова Думка, 1989- 280с.
37. Harris R., Wrigh M., Byrne M., Vernum J., Drightwill B., Shubert K. Callus formation and plantlet regenеration from protoplasts derived from suspension culture of whtat.- Plant Cell Rep., 1988, v. 7, №7, p. 337-341.
38. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений.- К.: Наукова Думка, 1984-160с.
39. Скаржинская М.В. Получение гибридных клеточных клонов путем индивидуального культивирования одиночных продуктов слияния изолированных протопластов // Украинский ботанический журнал –
№ 980. -36, № 6.-С.-58-73.
40. Пастернак Т.П., Мельников П.В., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация клеток высших растений с помощью микроинъекций ДНК //Известия Ан СССР. – 1986.-№ 2.- с. 314-316
41. Сахно Л.А., Скаржинская М.В. Регенерация растений из изолированных протопластов Brassica.- Физиология растений АН СССР, 1990,т. 37, вып.1, с.188-193
42. Мельников П.В., Пастернак Т.П., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Микроинъекции ДНК в клетки высших растений // Докл. АН УССР.- 1985. - № 10.-С. 69-71.
43. Мезенко А.В., Бутенко Р.Г., Родионова Н.А. Получение изолированных протопластов из мезофилла ячменя и многолетних трав.- Физиология растений АН СССР, 1976, т.23, вып 3, 508-513
44. Nagata T., Takebe I. Plating of isolated tobacco mesophill protoplast on agar medium.- Planta, 1971, v.99, p. 12-20
45. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г, Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И., Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике.- В книге Основы сельскохозяйственной биотехнологии. – М.: В.О. Агропромиздат. 1990-с. 154-236.
46. Marton L., Wullems G., Molendijk K., Schilperoort R. In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens // Nature.- 1979.-277.-p. 129-131.
47. Винклер Г.Н., Бутенко Р. Г. Применение черенкования при выращивании безвирусных растений картофеля методом культуры меристем // Физиология растений. - 1970. Т. 17. - С. 851-853.
48. Остапенко Д.П. Получение клубней в культуре in vitro как способ микроразмножения и сохранения коллекции сортообразцов картофеля // Культура клеток растений в биотехнологии. - Кишинев, 1983.
49. Трофимец Л.Н., Князева В.П., Варицев Ю.А. Диагностика вирусов картофеля методом ИФА // Селекция и семеноводство картофеля. - М.: Агропромиздат, 1985. - С. 81-86.
50. Meulemans M., Dumont I. Ancean C. et ol. In vitro tuberi sation of potаtо – Meded. Fab. Landbouwetensch. Rijksuniw // Genet. 1986, Vol. 51. - Р. 527-532.
51. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. – Алматы: “Конжык” 1996. - С.113-116
52. Швидченко В.К., Лейман П.О., Зотиков В.И. Методы ускоренного размножения картофеля в безвирусном семеноводстве Северного казахстана. - 1991. - №9. – C. 71-73.
53.Катаева Н. В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983.
54. Биотехнология растений: культура клеток. М.: ВО Агропромиздат, 1989. 280с.
55.Трускинов Э.В. Клубнеобразование в культуре тканей картофеля как фактор его размножения и длительного хранения в коллекции. – Бюл. ВИР 1980 вып. 105.
Содержание
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………… 4
1. Основные требования к лаборатории …………………………………. 6
1.1. Лаборатория………………………………………………………….…6
1.2. Посуда, инструменты и материалы …………………………………..7
1.3. Асептические условия работы ………………………………………..8
1.4. Стерилизация лабораторной посуды, инструментов
и материалов…………………………………………………………………..8
1.5. Стерилизация растительного материала ………………………………11
1.6. Технология приготовления питательных сред ………………………..13
1.6.1. Состав питательных сред ……………………………………………..13
1.6.2. Приготовление питательных сред…………………………………....14
1.6.3. Стерилизация питательных сред ………………………………….....15
МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ IN VITRO……………………………………….......17
2. Изолирование и поддержание каллусных и сеспензионных
культур ……………………………………………………………………..17
2.1. Приготовление и стерилизация ………………………………………..17
2.2. Индукция и поддержание каллусных тканей ………………………....19
2.3. Пассирование (субкультирование) каллусных тканей ……………..22
2.4. Суспензионные культуры ………………………………………… ….22
2.5. Субкультивирование суспензионных культур ……………………… 25
2.5.1. Измерение роста клеток суспензии ………………………………. 25
2.6. Культура гаплоидных клеток ……………………………………… 27
3. Изолирование и культивирование протопластов. Клеточная селекция на устойчивость к ингибиторам метаболизма ………………………………. 32
3.1. Методы выделения и культивирования протопластов ……………….32
3.2. Культура протопластов …………………………………………………41
3.3. Индивидуальное культивирование протопластов в микрокаплях…...43
3.4. Клеточная селекция на устойчивость к аминоэтилцистеину
и этионину……………………………………………………………………46
МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ………………………………………………….49
4. Слияние протопластов…………………………………………………… 49
4.1. Соматическая гибридизация ………………………………………… 49
4.2. Механическая изоляция гибридных клеток и культивирование единичных гетерокариоцитов ………………………………………………52
4.3. Инактивация биохимическими ядами и облучением как прием селекции соматических гибридов …………………………………………..53
4.4. Методы анализа соматических гибридов …………………………… 54
4.5. Деление протопластов и регенерация растений ………………………54
МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ ……… 55 5. Трансформация растений с использованием систем протопластов ………55
5.1. Методы генетической трансформации растений. «Кокультивирование», «Листовые диски», «Прямой перенос генов» …………………………………55
5.2. Генетическая трансформация с помощью
микроинъекций ДНК…………………………………………………………….58
6.ЭМБРИОГЕНЕЗ, ОРГАНОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ …...…60
6.1. Соматический эмбриогенез……………………………………………...…60
6.1.1. Прямой соматический эмбриогенез на примере
культивирования нуцеллуса у Citrus …………………………………………..63
6.1.2. Непрямой соматический эмбриогенез …………………………………..63
6.2. Органогенез …………………………………………………………………65
6.2.1. Образование побегов каллусами ………………………………………...66
6.2.3. Регенерация растений непосредственно
из культивируемых эксплантов ………………………………………………..67
6.2.4. Регенерация растений из побегов, образующихся
из пазушных почек …………………………………………………………..… 68
6.2.5. Микроклональное размножение меристемных растений………………72
6.3. Регенерация растений из протопластов ………………………………..…76
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ ………………………………………………………...81
ЛИТЕРАТУРА ……………………………………………………………….….84
СОДЕРЖАНИЕ………………………………………………………………….88
Поиск по сайту: