Ферментті ерітінділерді дайындау

Алынатын протопластардың саны мен сапасы көптеген факторларға тәуелді болады, соның ішінде қолданылатын целлюло- және пектолитикалық ферментті препараттардың жиынтығы мен қатынасы, осмотик типі мен концентрациясы, ерітіндінің рН, түрлі протектердің қолданылуы, температура мен инкубация уақыты.

Түрлі түрдегі жапырақтардан және түрлі сорттағы картоптан протопластарды бөліп алу үшін 5мМ CaCI₂ қоспасы бар 0,5M сахароза ерітіндісіндегі 1% Cellulysin 0,5% Macerozyme R-10 немесе сондай осмотиктегі 0,5% Driselase ферменттердің қоспасын қолдану ұсынылады. Әдетте барлық компоненттерді 2 реттік дистильденген суда немесе протопластарды өсіру үшін қолданылатын орталарда ерітеді; ферментті ерітіндінің рН-н 5,6-ға жеткізеді. Кейбір ферменттердің (мыс, Driselase) ерімейтін қоспаларын 200-400g кездегі 10-20 минут бойы центрифугалаумен тұндырады. Дайындалған ерітінділердің стерилизациясын 0,2-0,45 мк өлшемдегі тесіктері бар мембранды фильтр арқылы немесе басқа да фильтрлеуші құрылғыларды қолданумен сүзу арқылы іске асырылады.

Оқшауланған протопластарды бөліп алу және тазалау

Мезофильді протопластарды бөліп алу үшін жапырақтарды (ұз-ғы 1мм-н кіші) жұқа сызықтармен кеседі және ферментті ерітіндінің беткі қабатына қояды, ал каллусты ұлпаны оның ішінде суспендирлейді. Инкубация уақыты мен оптимальды температурасын әрбір жағдай үшін таңдап алынуы қажет. Біздің объектілермен эксперименттерде протопластардың ұлпадан босатылуы 28^оC темп-да кезінде 14-18 сағаттан кейін байқалды.

Протопластарды ферментті ерітіндіден бөліп алу және тазалауда әдетте фильтрация –центрифугалау әдісі қолданылады. Бұл процедуралардың реттілігі мынадай:

1. Ферментті ерітіндідегі инкубациядан кейін протопластардың тотальды препаратын нейлон елегі арқылы фильтрлейді (тесіктер өлшемі 50-100 мкм).

2. Бұндай жолмен алынған протопластар суспензиясын 100 g-да 2-3 мин центрифугадан өткізеді.

3. Сахарозада флотталған протопластарды пастер пипеткасымен ұстап алып, центрифужды пробиркаға ауыстырады, мұнда 0,5-1,0 мл протопластар суспензиясына 8-10мл W-5 тұзды ортаның келесідей құрамын қосады: 0,9% NaCI, 1,84% CaCI₂ 0,08% KCI және 0,1% глюкоза, рН 5,7.

4. Протопластар тұнбасын 2 рет W-5 ортада 80-100 g-да 3 мин бойы центрифугалау арқылы шаяды.

Протопластарды өсіру және өсімдік регенерациясы

Картоп протопластарын өсіру үшін келесі орталар ұтымды қолданылады: V-KM (22), CL (26), W-S-S және SW. Картоп протопластарын өсіру үшін қоректік ортаның құрамы 8 кестеде көрсетілген.

Протопластарды өсіру үшін 0,9% NaCI, 1,84% CaCI₂ 0,08% KCI құрамы бар W-5 ортасындағы протопластардың қою суспензиясының 2-3 тамшысын Петри табақшасына (60х15мм) ауыстырады, мұнда өсіру үшін 2-3 мл ортадан құяды. Ортаның мл-не протопластардың мүмкін болатын концентрациясы -10⁴-10⁶. Өсіруді шашыраңқы жарықта +25+27^оС темп-да өткізеді. Әрбір 6-10 күн сайын клеткалар суспензиясына жаңа қоректік ортаны қосады және суспензияны араласу мөлшеріне қарай Петридің басқа табақшаларына ауыстырады. Алынған микроколонияларды ST-1 агарланған ортаға құяды. Бұл үшін клетка суспензиясының 1-2 мл-н Петри табақшаларына (100-20 мм) ауыстырады және табақшада 150-25 колония алу мақсатында 10-15 мл жылы (40-45^оС) агарланған ортаны қосады. Петри табақшаларына қосатын жібітілген ортаны агардың соңғы концентрациясы 0,7% болатын есеппен дайындайды. Өсіруді 24^оC температурада, жарықта (16-сағаттық фотопериод кезде 3-4 килолюкс) өткізеді. 10-20 күннен кейін бөлек колонияларды агардан бөліп алуға болады және 10-15 күнге ST-1сол орталық бетіне отырғызу қажет. Өсірудің шарты бойынша колонияның түсі қанық-жасыл түсті болу керек. Органогенездің индукциясы үшін 1-3 мм диаметрімен алынған каллустар ST-2 ортасының бетіне ауыстырылады және 24^оС температурада, 16-сағаттық фотопериодта 3-4 килолюкс жарық кезінде, 25-30 күн бойы өсіріледі. Көбіне өсімдік регенерациясы үшін колонияны жаңа ST-2 ортасына қайталап отырғызу қажет.

8 кесте

Картоп протопластарын өсіру және олардың регенерациясы үшін қоректік орталар

Топыраққа картопты көбіне тамырланған өскіншелер түрінде отырғызады, ин витрода индуцирленген түйнек түрінде сирек отырғызады.

Поиск по сайту: