Микробные амилазы

К группе амилотических ферментов относятся a- и b-амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выра­женной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримо­лекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.

Глюкоамилаза и b-амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

При изучении механизма действия амилаз имеются определенные слож­ности, и прежде всего они заключаются в том, что субстрат - крахмал неод­нороден и имеет различные характеристики по степени полимеризации гликозидной цепи и количеству ветвлений.

Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во время первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йо­дом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы.

1.1 α-Амилаза

Фермент α-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1.) яв­ляется эндоамилазой, вызывающей гидролитическое расщепление a-1,4-гликозидных связей в амилозе, амилопектине и гликогене. а-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий молекулярную массу45 000-60 000. В зависимости от вида микроорганизма свойства α-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности. Действуя на целое крахмальное зерно, a-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Воздействие α-амилазы приводит к резкому уменьшению вязкости крахмальных растворов.

Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомоле­кулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йо­дом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов. Гидролиз амилопектина приводит к накоплению в реакционной среде низкомолекулярных разветвленных предельных α-декстринов, в состав которых входят 4 и более глюкозидных остатков, соединенных α-1,6-связями, а также мальтозы и глюкозы. Помимо воздействия на амилопектин и гликоген α-амилаза на второй стадии гидролиза расщепляет мальтотриозы, а также осуществляет медленный гидролиз специфических связей α-­предельных декстринов вблизи точек разветвления.

Разжижающие и осахаривающие α-амилазы отличаются по механизм расщепления крахмала, так как продукты осахаривающей α-амилазы обладают в два раза большей редуцирующей способностью по сравнению с продуктами действия разжижающих ферментов. Культуры Bacillus subtilis var. amylosacchariticus, В. subtilis Marburg и В. natto образуют осахаривающие α-амилазы, В. amyloliquefaciens продуцирует большое количество разжижающей α-амилазы.

α-Амилазы обычно стабильны в интервале рН от 5,5 до 8,0, а также при экстремальных значениях рН в присутствии кальция. Наивысшая активность проявляется при рН 4,8-6,5. Однако формы кривой рН - активности, а также абсолютная величина оптимума рН ферментов различного происхождения не одинаковы. Высокоочишенные препараты α-амплазы быстро теряют активность при температуре выше 50°С, но в присутствии кальция инактивация может замедляться. В присутствии кальция они вполне устойчивы к экстремальным значениям температуры и рН, обработке мочевиной, кислотой и воздействию протеаз. Тяжелые металлы, такие, как медь, ртуть, серебро и свинец, ингибируют α-амилазы.

Разжижение - процесс дисперсии нерастворимых гранул крахмала в водном растворе протекает при частичном гидролизе полисахарида с использованием термостабильной амилазы. Крахмальные гранулы нерастворимы, но при нагревании в водном растворе они набухают, разрушаются и крахмал диспергирует. Температура полной дисперсии для клейстеризации большинства крахмалов составляет 105 – 110 ^оС. В промышленных процессах разжижения крахмальная суспензия обычно имеет концентрацию 35 %, в процессе клейстеризации вязкость стремительно растет. Термостабильная α-амилаза используется в качестве разжижающего агента, который уменьшает вязкость и частично гидролизует крахмал. Таким образом, при последующем охлаждении исключается возможность спонтанного осаждения крахмала. Традиционно в качестве разжижающего агента в технологии крахмала использовалась соляная или щавелевая кислоты (процесс вели при рН 2,0 и температуре 140 - 150°С в течение 5 мин). При использовании термостабильной α-амилазы условия процесса смягчаются, в результате снижается образование побочных продуктов и получается более чистый продукт с меньшей стоимостью. Широко используются в технологических процессах обработки крахмала два вида термостабильной α-амилазы: амилаза В. amyloliquefaciens и амилаза В. licheniformis.

Термолабильные α-амилазы используются в качестве фермента, осахаривающего предварительно разжиженный крахмал. Эти ферменты недостаточно термостабильны для того, чтобы их можно было использовать в процессах разжижения, однако они обладают большей гидролитической активностью, чем разжижающие ферменты. Получаемый продукт содержит большие количества мальтозы. Применяемый в промышленном производстве крахмалопродуктов фермент получают из штаммов культуры A. oryzae. Оптимальные значения температуры и рН для этого фермента равны 55 ^оС и 4,7, и они значительно ниже, чем для термостабильных ферменов.

α-Амилаза, найденная в культуральной жидкости Streptomyces ргаесох, привлекает внимание тем, что единственным продуктом расщепления крахмала является мальтоза. В отличие от β-амилазы, которая гидролизует α-1,4-эндоглюкозидные связи, этот фермент образует мальтозу из мальтотриозы без образования глюкозы.

Механизм действия α-амилаз зависит от специфических свойств ферментов и условий гидролиза.

Возможные варианты действия α-амилаз на молекулярном уровне можно установить при полном теоретическом анализе различных способов воздействия амилаз на субстрат: многоцепочечный, одноцепочечный и комбинированный способы.

По многоцепочечному способу молекула фер­мента в случайном порядке атакует одну из полисахаридных цепей, отщепляет от нее звено (мономер или димер) и затем также в случайном порядке атакует следующие цепи, в том числе, возможно, и атакованную ранее. Таким образом, за время существования фермент-субстратного комплекса происходит только один каталитический акт.

По одноцепочечному способу молекула фермен­та, атаковав в случайном порядке одну из полисахаридных цепей, последовательно отщепляет от нее звенья до тех пор, пока цепь полностью распадется. Лишь после этого фермент атакует следующие цепи. За время существования одного фермент-суб­стратного комплекса гидролизуются все доступные для фермента связи.

Комбинированный способ, или способ мно­жественной атаки, заключается в том, что за время су­ществования одного фермент-субстратного комплекса гидролизуется несколько связей. При этом после отщепления одного звена от цепи фермент не отталкивается, а задерживается. Атака про­исходит с чередованием одно-_и многоцепочечного способов.

Фермент может переключаться с одного механизма действия на другой в зависимости от условий эксперимента, и при этом могут наблюдаться комбинации нескольких механизмов. Степень участия α-амилаз в различных механизмах каталитического расщепления прежде всего зависит от длины цепи субстрата. [9]

1.2 b-Амилаза.

b-Амилаза (a-1,4-глюкан мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий свойст­вами альбумина. Представляет собой экзофермент концевого дей­ствия, проявляющий срод­ство к предпоследней b-1,4 - связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы и амилопектина. В отличие от a-амилазы b-амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидро­лизуется ею с образованием мальтозы b-конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с a-амилазой на­зывается b-амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Если субстратом для b-амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. b-Амилаза отщепляет фрагмент с не­редуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12молекул мальтозы. Гид­ролиз приостанавливается на предпоследней a-1,4-связи, граничащей с a - 1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значи­тельное количество а-1,6-связей - так называемые b-декстрины. b-Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са²⁺. Молекулярная масса b-амилазы растений достаточно высока, она составля­ет от 50 000до 200 000. Фермент чувствителен к действию тяжелых метал­лов. Считается, что b-амилаза обладает высокой спо­собностью к множествен­ной атаке субстрата. Для амилозы средней молеку­лярной массы в одном при­соединении фермента к суб­страту возможно отщепле­ние до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы суб­страта возможно и большее количество мест атаки. [9]

1.3 Глюкоамилаза

. Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими ми­кроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различ­ными названиями: амилоглюкозидаза, g-амилаза, лизосомальная a-глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4-a-глюкозидаза.

Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков a-D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и a-1,4-связь, гидролизовать a-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за a-1,6-связью следует a-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. От­личительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго-и дисахариды.

Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Угле­водный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через трео­нин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство из­вестных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.

РН-стабильность микробных глюкоамилаз лежит в широком диапазоне -от 2,5 до 9. Термостабильность глюкоамилаз лежит в интервале от 30 до 45°С и редко повышается до 55-60°С. Глюкоамилазы различного происхо­ждения заметно отличаются по молекулярной массе, которая, по данным различных авторов, имеет значения от 48 000 до 210 000. Следует заме­тить, что далеко не все микробные глюкоамилазы способы полностью гид­ролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа:

1) полностью гидро­лизующие крахмал до глюкозы и

2) гидролизующие крахмал до глюкозы на 80-85%.

В то время предполагалось, что степень гидролиза зависит только от свойств глюкоамилаз и их происхождения. Позже было показа­но, что при росте культуры параллельно накапливаются и другие амилоли­тические ферменты, обладающие не только гидролитическим, но и трансферазным действием. Это гликозилтрансфераза и a-амилаза. Даже в слу­чае, если система открытая и продукт гидролиза (глюкоза) постоянно уда­ляется из системы, процесс может дойти до полного гидроли­за крахмала до глюкозы. Если же система закрытая и концентрация суб­страта велика, то при достижении определенной концентрации глюкозы в реакционной среде в результате переноса глюкозильных остатков на глю­козу, ди- и олигосахариды начинают накапливаться изомальтоза, паноза, нигероза, изомальтотриоза и другие сахара, которые имеют горький вкус. В результате процесс не может дойти до полного превращения крахмала в глюкозу и возникает ошибочное представление, что глюкоамилаза не пол­ностью гидролизует крахмал. Сама же глюкоамилаза может проявлять не­большую трансферазную активность, но только при концентрации глюко­зы свыше 60-70%. Поэтому ранее принятое деление глюкоамилаз на два типа следует считать необоснованным. [9]

1.4 Декстриназы

К этой группе ферментов относятся амилазы, способные гидролизовать α-1,6-глюкозидные связи в амилопектине, гликогене и других субстратах. Группу ферментов, объединенных под общим названием декстриназы или дебранчинг-ферменты, можно разделить на две подгруппы: истинные и условные (косвенные) декстриназы.

Истинные декстриназы гидролизуют α-1,6-глюкозидные связи в немодифицированном амилопектине и гликогене; таким образом, в образовании фермент-субстратного комплекса участвуют фрагменты цепочки различной длины. Истинные декстриназы классифицируются на пуллулуназы и изоамилазы по принципу субстратной специфичности. Пуллулуназа катализирует гидролиз α-1,6-глюкозидных связей в пуллулане, амилопектине, гликогене и в предельных декстринах, полученных при гидролизе амилопектина и гликогена α- и β-амилазами. Изоамилаза гидролизует α-1,6-глюкозидные связи в точках разветвления молекул гликогена, амилопектина и β-предельных декстринов.

При совместном действии пуллуланазы и β-амилазы происходит почти полная конверсия амилопектина и гликогена до мальтозы, что доказывает способность пуллуланазы отщеплять от предельных декстринов фрагменты, состоящие из двух – трех глюкозных остатков.

Причем при совместном действии пуллуланазы и β-амилазы на клейстерризованный крахмал выход мальтозы составляет 90%. Высокомальтозные сиропы получают и зи растворимого крахмала с использованием пуллуланазы одновременно с β- или грибной α-амилазой (выход мальтозы 88-90%).

1.4 α-Глюкозидаза

α-Глюкозидаза (КФ 3.2.1.20, α-D-глюкозидглюкогидролаза) катализирует гидролиз α-1,4-связей с нередуцирующего конца субстрата, отщепляя глюкозу. Она быстро гидролизует дисахариды и олигосахариды относительно больших размеров. [9]

Поиск по сайту: