Ферментативный гидролиз крахмала

Химизм гидролиза.

Независимо от природы катализатора при разрыве каждой α-1,4- и α-1,6-глюкозидной связи в крахмале по месту разрыва присоединяется молекула воды:

Исследования по гидролизу крахмала амилазами в Н₂О (с меченым кислородом) показали, что они катализируют разрыв глюкозидных связей между С₁и О. В амилозе при разрыве α-1,4-глюкозидной связи гидроксил воды присоединяется к пер­вому углеродному атому левого остатка глюкозы, образуя альдегидную группу в скрытой (полуацетальной) форме, водород воды присоединяется к кислороду глюкозидной связи при четвертом углеродном атоме правого остатка глюкозы. Гидролиз амилопектина в точке ветвления (а- 1,6-глюкозидной связи) сопровождает­ся присоединением гидроксила воды также к первому углеродно­му атому, а водорода воды — к шестому углеродному атому.

В пределе — при разрыве всех глюкозидных связей — присо­единяется п— 1 молекул воды (где п — число глюкозных остатков в макромолекулах амилозы и амилопектина) и образу­ется п молекул глюкозы. Так как п очень велико, то числовое значение n —1 будет практически пренебрежимо мало отличаться от n и реакция гидролиза может быть выражена уравнением:

(C₆H₁₀O₅) _n + n H₂O = n C₆H₁₂O_6.

Или применительно к одному глюкозному остатку:

C₆H₁₀O₅ + H₂O = C₆H₁₂O_6.

162 18 180

Отсюда теоретический выход глюкозы в процессе гидролиза составляет 111,11 % к массе крахмала. [12]

Кинетика гидролиза крахмала.

Механизм действия всех ферментов основан на образовании неустойчивых промежуточных соединений — комплексов из реа­гирующих молекул субстрата и активных центров ферментов. При этом в реагирующих молекулах происходит деформация, обеспечивающая вступление их в реакцию. После реакции фер­мент и химически измененный субстрат отталкиваются один от другого и фермент может реагировать с новой молекулой суб­страта. Все сказанное можно представить в виде следующей схемы:

K₁

S + E ↔ ES (1)

K _-1

K₂

ES → P + E (2)

Скоростью химической реакции V называют первую производ­ную от концентрации любого из исходных веществ или конечных продуктов реакции во времени τ. Таким образом уравнение для скорости ферментативной реакции (уравнение Михаэлиса-Ментен) имеет вид:

V = dP/ d τ = - dS/ d τ = (K₂ · E₀ · S) / (K_M + S), (3)

где V – скорость ферментативной реакции,

S, P – концентрации субстрата и продукта соответственно,

E₀ – начальная концентрация фермента,

K₂ – константа скорости образования продукта из фермент-субстратного комплекса,

K_M – константа Михаэлиса, K_M = (K -₁ + K₂) / K₁,

где K -₁ , K₁ , K₂ - константы скоростей реакций, соответствующих схеме (1).

Фермент дозируется в зависимости от такой величины как единицы активности.

Единица активности - это такое количество фермента, которое при 30 ^оС за 1 минуту превращает 1 микромоль субстрата в продукт. Скорость реакции зависит еще от концентрации субстрата и величины рН. Для каждого фермента эти стандартные условия его "дозирования" заранее определены. Таким образом, количество фермента определяется по кинетике модельной реакции, и точное определение приходящейся на единицу активности массы фермента обычно неизвестно. Можно определить лишь концентрацию фермента в единице массы или объема вещества, проявляющего ферментативную активность, в ед. г или ед. мл.

В Уравнении (3) произведение K₂ · E₀ можно заменить на V _max.

В результате получается принятый в ферментативной кинетике вид уравнения:

V = V _max · S / (K _м +S) (4)

Для определения констант V _max и K _м используют координаты Лайнувера и Бэка:

1/ V = K _м / (V _max · S) + 1/ V _max

при 1/ V =0 1/ S = - 1/ K _м

при 1/ S = 0 1/ V = 1/ V _max

Рис. 5 Определение коэффициентов уравнения методом Лайнуивера и Бэрка (двойных обратных координат).

Другой вариант – координаты Корниш – Боудена (V и V/S):

V = V _max - K _м · V/S

при V/S = 0 V = V _max

при V = 0 V/S = V _max / K _м

Рис. 6 Определение коэффициентов уравнения методом Корниш – Боудена.

Кинетика гидролиза крахмала зависит в основном от актив­ности и концентрации ферментов, температуры и концентрации водородных ионов.

Ряд условий может подавлять эффективность действия ферментов или снижать скорость ферментативной реакции. Кроме того, существует большое количество специфических ингибиторов, действующих различным образом.

В ферментативной кинетике кроме уравнения Михаэлиса - Мэнтен существуют уравнения, учитывающие ингибирование субстратом:

V = V _max · S/ (K _м +S + S²/ K_i), (5)

где K_i - константа ингибирования.

Конкурентное и неконкурентное ингибирование вторым субстратом описывается уравнениями:

V = V _max · S₁/ (K _м +S₁ + S₂/ K_i) (конкурентное); (6)

V = (V _max · S₁ / (K ₁ +S₁)) · (1/(1+ S₂/ K₂)) (неконкурентное), (7)

где K ₁ – константа Михаэлиса по субстрату S₁,

K₂ – константа ингибирования по субстрату S₂ .

Поиск по сайту: