Найважливіші характеристики деяких стафілококів

Для виявлення джерел інфекції та шляхів її передачі, особливо при спалахах захворювань у пологових будинках і хірургічних стаціонарах, проводять фаготипування виділених культур за допомогою міжнародного набору стафілококових бактеріофагів.

Фаготипування стафілококів

Обов’язково визначають чутливість виділених культур до антибіотиків з метою призначення для лікування раціональних хіміотерапевтичних препаратів. (детально план лабораторних досліджень приводиться

е).

Взяття матеріалу для дослідження. При стафілококових інфекціях досліджують гній, кров (при сепсисі), виділення слизових оболонок, мокротиння, запальний ексудат, ліквор, рановий вміст, плевральний випіт, жовч, сечу. В разі підозри на токсикоінфекцію  блювотні маси, промивні води шлунка, випорожнення, залишки їжі (особливо сир, молоко, тістечка, торти, креми, морозиво та ін.). При санітарно-бактеріологічних контролях досліджують змиви з рук, столів та інших предметів. У бактеріоносіїв матеріал забирають тампоном роздільно з глотки та носових ходів.

Із відкритих гнійних уражень матеріал беруть стерильним ватним тампоном після видалення ранового нальоту, в якому може бути сапрофітна мікрофлора з повітря, шкіри тощо. При закритих гнояках роблять пункцію стерильним шприцом. Слиз із рото- й носоглотки беруть стерильним тампоном. Мокротиння й сечу забирають у стерильні пробірки, банки. Кров (10 мл), взяту із ліктьової вени, й ліквор  при пункції спинномозкового каналу, з дотриманням асептики сіють біля ліжка хворого в 100 мл цукрового бульйону. Кров рекомендують швидко (до її згортання) вносити прямо із шприца у флакон з бульйоном, ретельно перемішати, запобігаючи утворенню згустка. Проби крові не можна заморожувати. У 25 % випадків при стафілококовому сепсисі кількість бактерій в крові (КУО) може бути менше 1/мл. При підозріванні на такий стан необхідно сіяти 25-30 мл крові.

Бактеріоскопічне дослідження. Майже з усіх досліджуваних матеріалів (гній, рановий вміст, ексудат, мокротиння, осад сечі тощо) за допомогою бактеріологічної петлі виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Лише з крові та змивів мазки не роблять так як в них мала кількість мікроорганізмів. У типових випадках стафілококи мають кулясту форму, фіолетовий колір, розташовуються несиметричними гронами, але зустрічаються й одинокі клітини, пари або тетради. Останнім часом у звязку з широким використанням антибіотиків морфологія стафілококів змінилась і типового їх розташування в мазках із гною часто не спостерігають. У звязку з цим відрізнити стафілококи від стрептококів за їх морфологією та взаємним розташуванням часто практично неможливо. Тому потрібно робити посів, виділяти чисту культуру та ідентифікувати її.

Але й первинна мікроскопія може дати попередню відповідь в разі виявлення типових грампозитивних коків правильної круглої форми, розташованих гронами і при великій кількості бактерій у полі зору. Вона також дає змогу вибрати необхідні для посіву елективні середовища, провести пряме визначення чутливості до антибіотиків мікрофлори гною ще до виділення чистої культури.

Бактеріологічне дослідження. Матеріал від хворих і бактеріоносіїв засівають негайно або не пізніше 3-4 год після взяття при умові зберігання його на холоді.

В перший день петлею, шпателем або безпосередньо тампоном роблять посіви на кровяний агар та елективні для стафілококів середовища (жовтково-сольовий (ЖСА) або молочно-жовтково-сольовий агар (МЖСА). Чашки з посівами інкубують при 37 С протягом 48 год, або одну добу в термостаті й додатково 24 год при кімнатній температурі при хорошому освітленні. Якщо в досліджуваному матеріалі бактерій мало (дані мікроскопії)  посів для збагачення роблять ще й у тіогліколеве середовище.

На другий день проводять висів із цукрового бульйону на вказані елективні середовища, досліджують масивність росту й характер колоній після посівів інших матеріалів. На кровяному агарі стафілококи утворюють непрозорі, злегка опуклі колонії середніх розмірів з гладенькою, блискучою немовби полірованою поверхнею, чітко окресленим краєм, маслянистої консистенції. Патогенні штами утворюють навколо колоній прозорі зони гемолізу. На елективно-диференціальних середовищах, як правило, виростають лише колонії стафілококів. Зокрема на жовтково-сольовому агарі вони утворюють колонії із зоною помутніння навколо них і характерним райдужним вінчиком по периферії (лецитовітелазна реакція). На молочно-жовтково-сольовому агарі виявляють наявність пігменту, який може бути золотистим, палевим, білим, жовтуватим, оранжевим та ін.

Із всіх типів колоній виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують, виявляючи типові грампозитивні стафілококи. Не менше двох типових чи підозрілих щодо стафілококів колоній пересівають на скошений агар. У першу чергу відсівають колонії з гемолізом і ті, що дали позитивну лецитовітелазну реакцію. При відсутності таких колоній досліджують не менше двох пігментованих колоній, при мікроскопії яких виявили типові стафілококи. Пробірки з посівами вміщують у термостат при 37 С на 18-20 год.

В наступні дні проводять ідентифікацію виділених чистих культур, для чого перевіряють їх морфологічні й тінкторіальні властивості (забарвлення за Грамом), плазмокоагулюючу активність та інші властиві для стафілококів тести.

Плазмокоагулазу виявляють шляхом внесення виділеної культури у пробірку з цитратною плазмою кролика. Її можна приготувати в будь-якій лабораторії. У кролика із серця беруть 8 мл крові, вносять у пробірку з 2 мл стерильного 5 % лимонно-кислого натрію і ставлять у холодильник. Після повного осідання формених елементів плазму відсмоктують у стерильну пробірку. Вона може зберігатись у холодильнику 8-10 днів. Перед використанням її розводять 1: 5 (1 мл плазми і 4 мл ізотонічного розчину хлориду натрію) і розливають в аглютинаційні стерильні пробірки по 0,5 мл. Повну петлю культури стафілококів емульгують у плазмі і вміщують у термостат на 3 год, а потім залишають при кімнатній температурі на 18-20 год. Попередній облік згортання плазми проводять через 3 год, остаточний  на другий день. Дуже зручно користуватись стандартною сухою цитратною плазмою кроля. Перед вживанням в ампулу додають 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й після повного розчинення її розводять 1: 5. Плазма людини мало придатна для постановки реакції плазмокоагуляції, оскільки в ній можуть бути консерванти, лікарські речовини, антитіла, які можуть пригнічувати утворення плазмокоагулази.

Якщо виділена культура викликає гемоліз, коагулює плазму і дає позитивну лецитовітелазну реакцію, вже на третій день можна видати результат на наявність S. aureus. Якщо ж культура має лише плазмокоагулазу або тільки вітелазну активність, для остаточного встановлення виду стафілокока потрібно визначити додаткові критерії патогенності: ферментацію маніту в анаеробних умовах, ДНК-азну активність, продукцію лізоциму, фосфатази, а також визначити чутливість до новобіоцину.

Ферментацію маніту в анаеробних умовах можна визначати, використовуючи стандартне сухе середовище з манітом й індикатором ВР. Після його виготовлення й регенерації в пробірки добавляють по 1 мл стерильного вазелінового масла і засівають культуру уколом у стовпчик. Посіви інкубують у термостаті протягом 5 діб. При розкладі маніту середовище синіє. Ця проба позитивна у 94-96 % штамів S. aureus.

Визначення ДНК-ази. До сухого живильного агару додають наважку ДНК із розрахунку 2 мг на 1 мл середовища, яке потім стерилізують текучою парою 30 хв. Його можна зберігати в холодильнику протягом 2-х місяців. Перед використанням агар розплавляють, добавляють хлористий кальцій (0,8 мг на 1 мл). На підсушене середовище в одній чашці можна засіяти полосками до 16-20 культур. Після інкубації посівів протягом 18-20 год їх заливають 5 мл 1N HCl. Через 7-10 хв кислоту зливають і проводять облік. Соляна кислота, реагуючи з ДНК, утворює непрозорий білий преципітат. Якщо культура продукує ДНК-азу, остання деполімеризує ДНК і при додаванні соляної кислоти навколо полосок культур виникає прозора зона, що свідчить про наявність фермента ДНК-ази.

Гіалуронідазну активність визначають добавляючи до 0,5 мл бульйонної культури стафілокока 0,5 мл препарату гіалуронової кислоти з пупочних канатиків. Суміш інкубують 30 хв при 37 С і 10 хв при 4 С. У пробірку добавляють 4 краплі 15 % оцтової кислоти, струшують і через 5 хв роблять облік результатів. Відсутність згустка свідчить про наявність гіалуронідази, наявність згустка  про її відсутність. Для виготовлення гіалуронової кислоти свіжу пуповину новонароджених подрібнюють, заливають подвійною кількістю дистильованої води. Суміш витримують 24 год у холодильнику, потім нагрівають і кипятять до згортання шматочків пуповини. Отриманий гіалуронат фільтрують через ватно-марлевий фільтр і перевіряють на утворення згустка.

Лізоцимну активність стафілококів визначають за допомогою посіву виділених культур у вигляді бляшок на щільний живильний агар, до якого додають густу завись культури Micrococcus luteus. При виділенні лізоциму навколо бляшок виникають зони лізису (просвітління агару).

Визначення фосфатази проводять засівом культур на живильний агар, до якого заздалегідь додають паранітрофенілфосфат (0,5 мг на 1 мл середовища). Інкубація протягом 18-20 год при 37 С. Поява навколо посівів інтенсивного жовтого забарвлення, свідчить про виділення фосфатази.

Стійкість до новобіоцину визначають посівом культури на мясо-пептонний агар з новобіоцином (1,6 мкг/мл). Золотисті й епідермальні стафілококи чутливі до цього антибіотика, а S. saprophyticus  стійкий.

Реакція Фогес-Проскауера. Виділену чисту культуру сіють у глюкозо-фосфатний бульйон Кларка. Через три дні інкубації при 37 С до 1 мл культури додають 0,6 мл альфа-нафтолу та 0,2 мл КОН і струшують. При позитивній реакції через 3-5 хв появляється рожеве забарвлення.

Біологічне дослідження. Патогенні стафілококи, що викликають харчові токсикоінфекції, виділяють та ідентифікують так само, як і стафілококи взагалі. Вони відрізняються здатністю продукувати ентеротоками А, В, С1, С2, С3, D, Е, F, які характеризуються термостабільністю та антигенною специфічністю. Найчастіше зустрічаються типи А і D. Вказані токсини отримують шляхом посіву культури в спеціальне напіврідке середовище, інкубують 3-4 доби при 37 С в ексикаторах з 20 % СО₂. Середовище з токсином пропускають через мембранні фільтри № 3 і 4. Отриманий фільтрат прогрівають при 100 С 30 хв і вводять кошенятам-сисунам внутрішньоочеревинно або через зонд у шлунок. Через 30-60 хв у тварин виникає блювота, пізніше пронос і загальна прострація. Для виявлення ентеротоксинів у харчових продуктах, що спричинили токсикоінфекцію, ними скормлюють кошенят. Останнім часом ідентифікацію і типування ентеротоксинів проводять за допомогою реакції імунопреципітації в агаровому гелі. Це найпростіший і найчутливіший метод виявлення ентеротоксинів.

Серологічне дослідження при стафілококових інфекціях проводиться лише тоді, коли збудника виділити не вдається, наприклад, при хронічних процесах (остеомієліт, септикопіємія) особливо якщо вони довго лікуються антибіотиками. Серед сучасних серологічних реакцій найчастіше використовують РНГА та ІФА, зокрема для визначення антитіл до рибіттейхоєвої кислоти або інших видоспецифічних антигенів. Але ідентифікація антитіл до тейхоєвої кислоти вирішального значення не має, а результати часто суперечливі. До того ж, реактиви для їх визначення поки що малодоступні.

Дослідження на бактеріоносійство серед медичного персоналу проводиться двічі на рік. При планових бактеріологічних обстеженнях обовязково досліджують слиз із носа. Дослідження слизу із ротоглотки проводять вибірково, при наявності запальних процесів у зіві. Матеріал беруть із передніх відділів носа стерильним ватним тампоном і ним же сіють на ЖСА не пізніше, як через 2 год після взяття. Виділення та ідентифікацію S. aureus проводять так само, як і при дослідженні інших матеріалів.

При визначенні масивності обсіменіння стафілококами слизової носа тампон із досліджуваним слизом вносять у пробірку з 0,5 мл стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію, прополоскують його в рідині струшуванням протягом 10 хв, віджимають об стінки й видаляють. Рідину багаторазово перемішують піпеткою. Окремо піпеткою наносять 0,1 мл змиву на чашку із ЖСА і ретельно розтирають шпателем. Чашки з посівами інкубують при 37 С протягом 48 год, після чого підраховують кількість колоній. Якщо з 50 колоній S. aureus, що виросли, дві віднесені до одного й того ж фаготипу, правомірно вважати, що й всі інші колонії, ідентичні за морфологією та пігментом, належать до S. aureus аналогічного фаготипу.

Приклад для розрахунку: після посіву 0,1 мл змиву виросло 50 колоній S. aureus. Отже, у 0,5 мл буде 50  5 = 250 колоній або 2,5  10².

Масивність стафілококового обсіменіння, яке виражається числом 10² мікробних клітин, є помірною, при ній збудник в оточуюче середовище не виділяється. При виділенні  10³ бактерійних клітин рівень обсіменіння визначають як високий, при якому збудник виділяється у зовнішнє середовище не лише при кашлі та чханні, а й при спокійному диханні. За таких обставин треба обовязково проводити санацію бактеріоносіїв.

Визначення фаговарів золотистих стафілококів має важливе значення для встановлення джерела інфекції. Методика фаготипування приводиться в інструкції для використання стафілококових бактеріофагів. Штами S. aureus, виділені із слизових оболонок дихальних шляхів медперсоналу хірургічних стаціонарів і пологових будинків, треба фагоцитувати в обовязковому порядку, виділені від хворих  лише за епідпоказаннями. Для визначення фаговарів використовують міжнародний набір із 23 помірних фагів, які розділені на 4 групи:

1 група  фаги 29, 52, 52А, 79, 80;

2 група  фаги 3А, 3С, 55, 71;

3 група  фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 84, 85;

4 група  фаги 94, 95, 96;

поза групою  фаги 81, 187.

За допомогою вказаних фагів вдається типувати 60-80 % виділених культур. Встановлені особливі епідемічні штами S. aureus, які найчастіше циркулюють у стаціонарі при внутрішньолікарняних інфекціях (напр. фаготипи 77 і 80). Отримані також набори специфічних бактеріофагів для типування S. epidermidis.

У чистих культур стафілококів, виділених від хворих, обовязково визначають антибіотикограми з метою застосування адекватних препаратів для лікування або інтра- і периопераційної антибіотикопрофілактики. У стафілококових носіїв визначення чутливості культур до антибіотиків проводять лише за показаннями, наприклад, при необхідності вибирати препарат для санації. При цьому використовують дискодифузійний метод або спосіб серійних розведень.

Останнім часом у бактеріологічних лабораторіях широко стали використовувати СІБ та ПБДС для швидкої та більш економічної уніфікованої ідентифікації бактерій. Одну з таких систем одноразового застосування ПБДС для ензимної ідентифікації всіх коагулазопозитивних і коагулазонегативних стафілококів наводимо у скороченому варіанті.

Профілактика й лікування. Попередження виникнення та розповсюдження стафілококових інфекцій спрямовано на виявлення й лікування носіїв золотистих стафілококів особливо серед медичного персоналу пологових будинків, хірургічних та дитячих відділень лікарень. Необхідно чітко витримувати суворий санітарний режим роботи в лікарняних закладах, систематично проводити дезинфекцію. Для профілактики стафілококових інфекцій у пологових будинках важли-ве значення має раціональний режим стерилізації, пастеризації та збереження грудного молока. На промислових підприємствах для профілактики нагноєнь при мікротравмах застосовують захисні мазі та пасти. З метою підвищення протистафілококового імунітету практикують проведення імунізації стафілококовим анатоксином осіб, у яких часто виникають травми і мікротравми. При лікуванні гострих стафілококових захворювань призначають антибіотики, сульфаніламідні та нітрофуранові препарати, мірамістин. Вибір препаратів залежить від результатів визначення чутливості до них виділеної культури. Для лікування сепсису, остеомієліту та інших важких стафілококових інфекцій використовують імунологічні препарати: стафілококовий імуноглобулін, гіперімунну плазму. При хронічних захворюваннях застосовують стафілококовий анатоксин, аутовакцину.

Поиск по сайту: