Структура ДНК-полімерази й полімеразна реакція

Лекція № 9. РЕПЛІКАЦІЯ ДНК

1. Реплікон.

2. ДНК-полімераза.

2.1. Структура ДНК-полімерази й полімеразна реакція.

2.2. Редагування помилок.

2.3. Особливості ДНК-полімерази в порівнянні з РНК-полімеразою.

3. Реплісома та інші елементи системи реплікації.

3.1. Геліказа й білки SSB.

3.2. Синтез ланцюга, що запізнюється.

3.3. Голофермент ДНК-полімерази.

3.4. Топологічні проблеми, пов’язані з реплікацією.

4. Ініціація реплікації в бактерій.

5. Особливості еукаріотичної системи реплікації.

5.1. Еукаріотичні ДНК-полімерази.

5.2. Ініціація реплікації в еукаріотів.

5.3. Структурні зміни хроматину під час реплікації.

5.4. Подовження кінців еукаріотичної хромосоми.

6. Репарація ДНК.

6.1. Пряма репарація.

6.2. Ексцизійна репарація.

6.3. Репарація некомплементарних пар основ – місметчів.

6.4. Репарація без репарації.

6.5. Репарація дволанцюгових розривів.

Процес подвоєння ДНК – реплікація (replication) – забезпечує відтворення спадкової інформації та передачу її до дочірніх клітин при мітозі й мейозі. Синтез ДНК відбувається при реплікації з використанням обох полінуклеотидних ланцюгів як матриць – за так званим напівконсервативним механізмом: дві дочірні молекули копії містять один материнський ланцюг (що слугував матрицею) і один ланцюг, синтезований de novo. Включення нуклеотидів до ланцюга, що синтезується, детермінується матрицею за принципом комплементарності. Такий механізм реплікації став зрозумілим відразу після того, як Уотсоном і Кріком була сформульована модель подвійної спіралі ДНК.

Зростання ланцюга ДНК відбувається в напрямку від 5′- до3′-кінця. Субстратами реакції є 3′-кінцева ОН-група дезоксирибози зростаючого ланцюга та дезоксирибонуклеозидтрифосфати (dNTP). Фермент, що каталізує цю реакцію – ДНК-залежна-ДНК-полімераза (DNA dependent DNA Polymerase, DNAP). Синтез ДНК за подібними механізмами здійснюється також при репарації пошкоджень і деяких інших процесах.

Молекулярні механізми реплікації є спільними для всіх живих організмів. На початку ми розглянемо в основному бактеріальну систему реплікації. Далі – особливості реплікації в еукаріотів, а також процеси синтезу ДНК при репарації.

Реплікон

Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки – ориджина (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі по ходу реплікації такий реплікативний міхур (рис. 1) розростається у двох протилежних напрямках. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, у основі якої й відбувається синтез ДНК. Ділянку ДНК, де здійснюється реплікація, що розпочинається з однієї точки, називають репліконом. Бактеріальна хромосома, і зокрема в E. coli, часто містить тільки один ориджин, являє собою єдиний реплікон. У деяких бактерій може бути два реплікони на хромосому. Еукаріотична хромосома є полірепліконом – вона містить велику кількість точок ініціації.

У кожній реплікативній вилці працюють дві молекули ДНК-полімерази, що здійснюють синтез двох полінуклеотидних ланцюгів. Оскільки два ланцюги є антипаралельними, і синтез відбувається тільки в напрямку від 5′- до 3′-кінця, синтез тільки одного з ланцюгів може відбуватися (і відбувається) безперервно, починаючись від ориджина (рис. 1). Цей ланцюг називають лідируючим (leading strand), його 3′-кінець розташований поблизу від основи реплікативної вилки.

Рис. 1. Реплікативний міхур – дві реплікативні вилки, що переміщуються у протилежних напрямках (ланцюги, які синтезуються, показано тільки для однієї з них).

Синтез іншого ланцюга розпочинається від реплікативної вилки: синтезуються окремі фрагменти – так звані фрагменти Оказакі (Reiji Okazaki), які пізніше з’єднуються між собою. Довжина фрагмента Оказакі при реплікації у бактерій дорівнює 1 – 2 тис. нуклеотидів. Для синтезу кожного із фрагментів треба спочатку звільнити відповідний простір на матричному ланцюзі – пересунути реплікативну вилку вперед (рис. 1), відповідно, фрагментарний ланцюг називають ланцюгом, що запізнюється (lagging strand). Середня швидкість реплікації на одну реплікативну вилку становить ~750 нуклеотидів за секунду в бактерій, 60 – 90 нуклеотидів за секунду в еукаріотів. Синтез бактеріальної хромосоми відбувається за ~50 хвилин, повна реплікація ДНК еукаріотичної клітини – за кілька годин.

У більшості репліконів реплікація здійснюється таким чином, як зображено на рис. 9.1 – в обох напрямках. Сусідні реплікони еукаріотичної хромосоми врешті решт зустрічаються, і в результаті утворюються дві копії ДНК хромосоми (рис. 2).

Рис. 2. Реплікація еукаріотичної хромосоми.

Циркулярна бактеріальна хромосома також реплікується у двох напрямках з утворенням ідентичних циркулярних молекул ДНК (рис. 3).

Рис. 3. Реплікація циркулярної бактеріальної хромосоми.

Аналогічно реплікуються окремі автономні реплікони бактерій – циркулярні плазміди. Для деяких із них реплікація відбувається тільки в одному напрямку: в ориджині формується лише одна реплікативна вилка, яка рухається навколо кільця до вихідної точки. Особливий випадок – реплікація циркулярних ДНК за механізмом кільця, що котиться (rolling circle), який реалізується для ДНК бактеріофагів та деяких плазмід. Один із варіантів такого механізму (для бактеріофага λ) показано на рис. 4. В одному з ланцюгів циркулярної ДНК індукується одноланцюговий розріз, 3′-кінець, що утворився, добудовується з використанням інтактного циркулярного ланцюга як матриці. Продовження цього процесу створює довгий одноланцюговий 5′-кінцевий хвіст, що складається з тандемних повторів – копій кільцевої молекули. Кожен із цих повторів використовується як матриця для синтезу іншого ланцюга. Після цього лінійні дволанцюгові фрагменти вирізаються та упаковуються до частинок бактеріофага.

Рис. 4. Реплікація циркулярної ДНК бактеріофага λ.

ДНК-полімераза

У клітині E. coli працюють ДНК-полімерази трьох основних типів.Усі вони мають дві ферментативні активності: власне полімеразну, за рахунок якої до 3′-кінця ланцюга, що синтезується, приєднуються нуклеотиди, і 3′-екзонуклеазну, яка використовується для редагування помилок – відщеплення помилкових нуклеотидів, щойно приєднаних до 3′-кінця.

• ДНК-полімераза І (або полімераза Корнберга (Arthur Kornberg)) – мономерний білок із мультидоменною структурою. На відміну від інших ДНК-полімераз вона має також додаткову 5′-екзонуклеазну активність. ДНК-полімераза І використовується як допоміжна полімераза при реплікації та інших процесах синтезу ДНК.

• ДНК-полімераза ІІ залучена до певних репараційних процесів.

• ДНК-полімераза ІІІ – основна реплікативна полімераза, дві копії якої працюють у реплікативній вилці. Складається з трьох субодиниць: субодиниця α- відповідає за полімеразну активність, ε- за 3′-екзонуклеазну, θ- – виконує структурну роль.

Структура ДНК-полімерази й полімеразна реакція

Структуру основної частини ДНК-полімерази І – так званий фрагмент Кленова (Hans Klenow) – показано на рис. 5 (додатковий домен полімерази відповідає за 5′-екзонуклеазну активність).

Рис. 5. Комплекс фрагмента Кленова ДНК-полімерази І із ДНК у полімеразному активному центрі (1L3T).

Подібну структуру мають більшість інших про- та еукаріотичних ДНК-полімераз. Полімеразний активний центр розташований у межах долоні (palm) – щілини, яка оточена двома характерними структурними доменами: рухливими пальцями (fingers) і великим пальцем (thumb). Великий палець взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі, утвореної матричним ланцюгом і таким, що синтезується. Пальці взаємодіють із матричним ланцюгом, який при цьому трохи вигинається навкруг пальців, експонуючи чергову азотисту основу для взаємодії з NTP. Сайт зв’язування NTP утворюється пальцями, залишками активного центру, нуклеотидом матричного ланцюга та 3′-кінцем ланцюга, що синтезується. Рухливість пальців дозволяє їм існувати у двох конформаціях:

• Відкрита передбачає рух полімерази вздовж ДНК і швидкий перебір NTP.

• Закрита, коли пальці переміщуються в напрямку до великого пальця, жорстко фіксуючи NTP у активному центрі та забезпечуючи каталіз полімеразної реакції.

Полімеразна реакція (рис. 6) передбачає, що ДНК-полімераза має розташувати 3′-кінцеву ОН-групу зростаючого ланцюга в активному центрі, зв’язати NTP, за умови його комплементарності до нуклеотиду матричного ланцюга здійснити каталіз синтезу фосфодіефірного зв’язку з одночасним відщепленням пірофосфату.

Рис. 6. Схема ДНК-полімеразної реакції.

На першій стадії елонгаційного циклу відбувається зв’язування NTP (рис. 7). ДНК-полімераза при цьому реалізує свою відкриту конформацію, яка дозволяє швидку асоціацію / дисоціацію різних нуклеотидів. Якщо нуклеотид виявляється комплементарним матриці, з парою основ реалізуються численні взаємодії активного центрута його оточення. Це індукує конформаційну зміну в полімеразі (найповільніша лімітуюча стадія циклу) із переміщення пальців, наслідком чого є фіксація NTP у активному центрі (рис. 8) і нерухомість полімерази відносно ДНК. На третій стадії здійснюється каталіз реакції. Після приєднання нуклеотиду відбувається дисоціація пірофосфату й розмикання полімерази. Оскільки утворився новий продовжений 3′-кінець, який має спорідненість до активного центру, на останній стадії здійснюється транслокація – переміщення полімерази в її відкритій формі на один нуклеотид уздовж матриці.

Рис. 7. Елонгаційний цикл ДНКполімерази.

Рис. 8. Нуклеозидтрифосфат (СТР) та іон Mg²⁺ (фіолетовий) в активному центрі ДНК-полімерази (1LV5). Матричний ланцюг синій, зростаючий – червоний.

Принципова схема елонгаційного циклу ДНК-полімерази практично не відрізняється від такої РНК-полімерази. Механізм каталізу ДНК-полімеразної реакції також є цілком аналогічним: ключову роль у каталізі виконують два іони Mg²⁺, що утримуються в активному центрі трьома залишками Asp.

Поиск по сайту: