Формирование и созревание фагосомы

Погружение частицы обусловлено сокращением нитей актина, скоецентрированных вокруг чаши. Сразу после образования фагосома не несет бактерицидных вешеств. Перемещаясь внутрь клетки, фагосома созревает, сливаясь с гранулами фагоцита. Решаюший этап созревания – слияние с лизосомами.

Заключительный этап фагоцитоза – выброс содержимого фагосомы путем дегрануляции.

Нейтрофилы погибают.

Нейтрофильные ловушки ( NETs ).

По мнению ученых из Max-Planck-Institute for Infection Biology (Германия), лейкоциты могут уничтожать бактерий путем заключения их во внеклеточные структуры, выполняющие функции ловушек. Нейтрофилы, составляющие большинство (50-80%) белых кровяных телец, поглощая и разрушая патогенные микроорганизмы, являются первой линией защиты организма от попавших извне бактерий. Согласно данным исследования, проведенного специалистами отдела клеточной микробиологии под руководством Arturo Zychlinsky, у нейтрофилов существует и другой, еще не изученный защитный механизм. Оказывается, они могут "выбрасывать" сетевидные образования, в которых задерживаются, нейтрализуются, а затем и погибают микроорганизмы. Эти новые структуры получили название нейтрофильных экстрацеллюлярных ловушек (NET-Neutrophil Extracellular Traps). Результаты работы были опубликованы в издании "Science" в конце 2004 года. Контакт с патогенными микробами и/или воздействие провоспалительных цитокинов запускает в нейтрофилах респираторный взрыв с последующей инициацией клеточной гибели (нэтоз), которая отличается от апоптоза и некроза.

Нейтрофильные экстрацеллюлярные ловушки (НЭЛ, NETs) представляют собой очень тонкие нити, определяемые только с помощью электронной микроскопии. Вместе с небольшими глобулами они образуют более сложные структуры. Одним из компонентов НЭЛ является хроматин. Эта смесь ДНК и белков является источником генетической информации и находится в клеточном ядре. Основными белками хроматина являются гистоны, которые отвечают за целостность структуры ДНК и принимают участие в разрушении микроорганизмов. НЭЛ содержат также и гранулы нейтрофильных белков, принимающих участие в обезвреживании микроорганизмов. Немецкие ученые в сотрудничестве со специалистами из Нью-Йоркского университета доказали, что НЭЛ очень эффективны в борьбе с шигеллами, сальмонеллами и стафилококками. Ученые смогли получить НЭЛ в экспериментальных клеточных культурах, в образцах тканей при дизентерии и в биоптате аппендикса человека.

Кроме нейтрофилов, способность высвобождать ДНК имеют также мастоциты, эозинофилы а также клетки растений. Для развития клеточной смерти, приводящей к формированию НВЛ, является необходимой продукция активных кислородных радикалов (АКР). Их накопление приводит к разрушению ядерной оболочки, попаданию хроматина в цитоплазму и его деконденсации. Далее хроматин связывается с гранулярными и цитоплазматическими антимикробными протеинами и выходит из клетки. (Интересно, что гистоны - один из основных компонентов НВЛ - имеют выраженную антимикробную активность.)

Молекулярные механизмы, связывающие продукцию АКР с деконденсацией хроматина и его объединением с антимикробными протеинами пока недостаточно изучены.

Высвобождение НВЛ изолированными нейтрофилами человека происходит через 2-4 часа после стимуляции микробами или активаторами протеинкиназы С (ПКС); при активации нейтрофилов тромбоцитами, активированными ЛПС НВЛ высвобождаются намного быстрее (предполагается, что это и происходит при сепсисе).

Необходимо еще раз подчеркнуть, что клетки, выбрасывающие свое ДНК наружу, при этом гибнут, а на сегодняшний день все описанные варианты гибели клеток сопровождаются разрушением их ДНК (некроз, апоптоз, аутофагия, митотическая катастрофа). И только гранулоциты обладают способностью не разрушать собственную ДНК при «альтруистическом» самоубийстве. Например, в случае некроза (насильственная, нерегулируемая гибель клетки) ДНК клетки распадается вследствие действия ферментов попадающих в клетку из-за нарушения целостности ее внешних покровов (мембраны) и также покровов ядра. В процессе апоптоза (генетически запрограммированная гибель клетки) клетка своими силами разрушает собственную ДНК прежде чем распасться на «кусочки». В условиях описываемого феномена нарушается целостность внешних покровов клетки, но ДНК из ядра при этом выходит целой. Поскольку нейтрофилы, попавшие в очаг воспаления, все равно обречены на гибель, то дальнейшее хранение и использование этой генетической информации им не пригодится. Зато суммарная длина ДНК каждой клетки составляет 2 метра!

В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов, среди которых доминирующими являются нейтрофилы, около 50% из них - это погибшие клетки, а остальные жизнеспособные и функционально активные. Контакт нейтрофилов с микроорганизмами приводит к гибели гранулоцитов, при этом лактобактерии и бифидобактерии индуцируют апоптотическую гибель нейтрофилов. Продукты нейтрофилов изменяют состав микробиоценозов слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта женщин: они подавляют рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), препятствуют адгезии грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия и существенно не влияют на содержание лактобактерий. 5. Нейтрофилы могут участвовать в регуляции микробиоценозов и в формировании колонизационной устойчивости слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин.

Методика обнаружения нейтрофильных ловушек (Долгушин Илья Ильич,
Андреева Юлия Сергеевна).

1. Взвесь нейтрофилов получают, используя 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивают в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и доводят до концентрации 5·10⁶ клеток/мл [1, 3].

2) Полученную взвесь клеток инкубируют при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин"), Lactobacterium spp.(препарат Лактобактерин сухой ), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл (по стандартному мутности БАК-10) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, содержащей 10⁸ Lactobacterium spp., 10⁶ Bifidobacterium spp., 10³S. aureus, 10³E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для контроля используют взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов [1].

3) После инкубации клеточную взвесь наносят на стекло и высушивают.

4) Для фиксации используют 96%-ный этиловый спирт, который наносят на мазок в количестве 100 мкл, после испарения спирта мазок считают фиксированным.

5) Для окрашивания нейтрофильных ловушек на фиксированный препарат наносят 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 минут в темноте. Раствор акридинового оранжевого готовят предварительно по следующей схеме: 5 мг сухого красителя растворяют в 5 мл физиологического раствора, полученный таким образом маточный раствор (1 мг/мл) хранят при Т=4°С. Перед использованием 0,2 мл раствора смешивают с 4,8 мл физиологического раствора, получая рабочий раствор

6) Учет проводят с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм, и эмиссию с длиной волны 520 нм. Ядра нейтрофилов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет.

При этом можно провести количественную оценку образования ловушек, так как при таком способе окраски хорошо различима морфология нейтрофилов: 1 группа объединяет клетки с сегментированным ядром, 2 группа включает клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе относят свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.

При предлагаемом способе окраски можно оценить как активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, так и показатели попадания бактерий-активаторов в нейтрофильные ловушки, так как имеется хороший контраст между нейтрофилами, их ловушками, окрашиваемыми в зеленый цвет, и бактериями, окрашиваемыми в оранжевый. Для этого рассчитывают следующие показатели:

1) активность фагоцитоза (%) - число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных клеток с сегментированным ядром;

2) интенсивность фагоцитоза (усл.ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку;

3) число нейтрофильных ловушек (%) - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур;

4) индекс нейтрофильной ловушки (усл.ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.

Предлагаемым способом окрашено 50 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль) и 4 группы по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp.или смесью бактерий соответственно (таблица 1, 2).

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [2].

Активность фагоцитов характеризуется фа­гоцитарными показателями и опсоно-фагоцитарным индексом.

Фагоцитарные показатели оцениваются числом бактерий, поглощенных или «переваренных» одним фагоцитом в еди­ницу времени, а опсонофагоцитарный индекс представляет отношение фагоцитарных пока­зателей, полученных с иммунной, т. е. содер­жащей опсонины, и неиммунной сывороткой. Эти показатели используются в клинической практике для определения иммунного статуса индивидуума.

Секреторная активность макрофагов. Т акая активность свойственна преимущественно активированным фагоцитирующим клеткам, но по крайней мере макрофаги выделяют субстанции (лизоцим, простагландин Е2) спонтанно. Активность выражается в двух формах:

1. выброс содержимого гранул (для макрофагов лизосом), т.е. дегрануляция.

2. секреция с участием ЭПР и аппарата Гольджи.

Дегрануляция свойственна всем основным фагоцитирующим клеткам, а второй тип исключительно макрофагам.

С остав гранул нейтрофилов разделен на две части, одни действуют при нейтральных или щелочных значения ph, другая кислые гидролазы.

Главная особенность макрофагов в сравнение с нейтрофилами, это значительно более выраженная секреция, не связанная с дегрануляцией.

Макрофаги спонтанно секретируют: лизоцим, компаненты комплимента, ряд ферментов (например, эластазу), фибронектин, апопротеин А и липопротеиновую липазу. При активизации значительно увеличивается секреция: С2, С4, фибронектина, активатора плазминогена, включается синтез цитокинов (ИЛ1, 6 и 8), ФНОα, интерферонов α, β, гормонов и др.

Активация макрофагов приводит к процессам дегрануляции фагосом и лизосом с выделение продуктов, аналогичных тем, которые выделяются при дегрануляции нейтрофилов. Комплекс этих продуктов обуславливает внеклеточный бактериолиз и цитолиз, а так же переваривание компонентов разрушенных клеток. Однако внеклеточная бактерицидная активность у макрофагов выражена слабее, чем у нейтрофилов. Макрофаги не вызывают массированного аутолиза, приводящего к формированию гноя.

Эозинофилы

0,5-2% лейкоцитов крови. Циркулируют 30мин -18 часов. Далее в ткань, там до 12 суток. Имеют сегментированное, двудольное ядро. Содержат крупные эозинофильные гранулы. Это специфические гранулы (главный щелочной белок, пероксдаза встраивается в стенку гкльминтов, нарушая их целостность). Еще первичные, мелкие и липидные тельца. Рецепторы для IgG и E.

Принципиально иную функцию имеют эозинофилы. Эти клетки играют основную роль в защите от слишком крупных для фагоцитоза патогенов – многоклеточные паразиты.

Есть в гранулах белки – противовирусная активность.

Им характерен внеклеточный цитолиз.

Участвуют в развитии аллергических реакций через активацию тучных клеток и базофиловю

Слабая фагоцитарная активность.

Часто мигрируют в пищеварительный тракт так как реагируют на эотаксины. Во время менструации и при беременности в матку.

Тромбоциты

Тромбоциты также играют важную роль в иммунитете. Они возникают из мегакариоцитов, пролиферацию которых усиливает ИЛ-11. Тромбоциты имеют на своей поверхности ре­цепторы к IgG и IgE, к компонентам компле­мента (С 1 и СЗ), а также антигены гистосовместимости I класса. На тромбоциты оказывают влияние образующиеся в организме иммунные комплексы антиген + антитело (АГ+АТ), акти­вированный комплемент. В результате такого воздействия тромбоциты выделяют биологи­чески активные

Поиск по сайту: