Методика и техника скрещивания

Техника скрещивания зависит от вида растения, особенностей его биологии, строения и размера цветка, способа размножения и оплодотворения. Скрещивание включает следующие этапы: 1) подготовка соцветия к скрещиванию; 2) кастрация и изоляция цветка; 3) сбор пыльцы с отцовского растения; 4) непосредственное опыление кастрированного материнского растения.

При работе с культурами, у которых кастрированный цветок может дать только одно семя (пшеница, ячмень, рожь и другие злаки), требуются большие затраты труда на получение нужного количества гибридных семян в отличие от мака, табака, у которых один цветок образовывает несколько сотен и тысяч семян.

К выбору цветка (соцветия) предъявляются следующие требования: 1) к моменту его кастрации он не должен быть оплодотворён; 2) цветок (или соцветие) должен быть нормально развит.

Подготовка колоса (пшеница, рожь, ячмень), намеченного к кастрации, сводится к следующему. Сначала с помощью пинцета удаляют менее развитые нижние и верхние колоски, оставляя обычно по пять с каждой стороны (у остистых форм предварительно обрезают ости). Затем у культур, у которых в колоске более двух цветков (пшеница, рожь, овёс), удаляют менее развитые средние цветки. В результате проведённой операции на подготовленном к кастрации соцветии оставляют чаще 18–22 цветка, после чего приступают непосредственно к кастрации.

У некоторых культур перед кастрацией удаляют венчик и чашечку цветка. У зерновых культур (пшеница, рис) можно обрезать верхнюю половину околоцветника вместе с пыльниками, не повреждая рыльце. Срезанные пыльники удаляют с помощью форвакуумного насоса ВН-461.

У самоопыляющихся культур кастрация при скрещивании обязательна. Для скрещиваниявыбирают хорошо развитые цветки.

У пшеницы оставляют 10–12 колосков в средней части колоса, а в каждом колоске – два нижних, самых развитых цветка. Кастрацию пшеницы лучше проводить, когда колос выйдет из раструба верхнего листа на ²/₃. Кастрацию начинают с нижнего колоска.

У ячменя цветки не собраны в колоски, а прикрепляются к стержню колоса самостоятельно. Опыление происходит до колошения, поэтому кастрацию проводят раньше, чем у пшеницы – в момент обозначения колоса в раструбе верхнего листа видны только верхушки остей. На каждом уступе оставляют только по одному среднему колоску.

Созревание пыльников у овса идёт одновременно с выбрасыванием метёлки из раструба верхнего листа. Поэтому цветки кастрируют в тот момент, когда покажутся первые 3–4 колоска. Пыльца овса очень чувствительна к температурным условиям. В жаркую сухую погоду она быстро теряет жизнеспособность, поэтому опыление лучше проводить в закрытых помещениях с ровной температурой в вегетационных сосудах или горшках. Рыльце цветка очень нежное и быстро отмирает под действием прямых солнечных лучей и сухого тёплого воздуха. Поэтому скрещивать овёс лучше вечером или рано утром. Для кастрации на метёлке оставляют по 8–12 наиболее развитых цветков, по одному нижнему в каждом колоске.

У проса растение к скрещиванию готовят на 2–3-й день после начала цветения метёлки. Пинцетом удаляют все малоразвитые верхние и нижние бутоны и отцветшие цветки, оставляя 60–70 самых развитых цветков в средней части. Лучшее время кастрации – утро (до 11 ч) и вечер (после 16 ч). Пыльники удаляют пинцетом или иглой.

Кастрацию гороха проводят в момент полного развития бутона. Отцветшие и недоразвитые цветки удаляют. В кисти оставляют 1–2 пригодных для кастрации цветка. Пинцетом отгибают в сторону флаг и крылья, прикрывающие лодочку. Затем препаровальной иглой разрезают лодочку вдоль киля и удаляют все тычинки. При удалении пыльников концом пинцета необходимо брать за тычиночные нити, так как пыльцевые мешочки легко разрываются. Опыление производят перенесением созревших пыльников с отцовского растения кисточкой или пинцетом сразу после кастрации или через 1–2 дня после неё, в момент созревания рыльца.

У картофеля для скрещивания оставляют 3–5 бутонов в соцветии, которые должны раскрыться, остальные удаляют. Пыльники удаляют остро отточенным карандашом после вскрытия венчика. После кастрации всё соцветие помещают в пергаментный изолятор. Можно не кастрируя изолировать только одно рыльце, надев на него полую соломину длиной 3–4 см. Опыляют сразу после кастрации, так как рыльце созревает на 3–4 ч раньше пыльников. Опыляют карандашом или пипеткой. Через 10–12 дн. после опыления изолятор снимают. Собранные ягоды дозаривают в тёплом помещении.

После выбора и подготовки необходимых для скрещивания соцветий или цветков осуществляют их кастрацию. Разработано несколько способов кастрации.

При термокастрации соцветия замачивают на несколько минут в тёплой воде (температура 42–44ºС) или подвергают воздействию низких температур (от –2,2 до –2,8ºС). Однако попытка использовать предварительно нагретую воду в качестве гаметоцида не увенчалась успехом (В.А. Зыкин, 1980).

Для химической кастрации используют селективные вещества, или гаметоциды, которые препятствуют развитию пыльников и пыльцы. Важно, чтобы они не оказывали мутагенного действия. Материнские растения опрыскивают гаметоцидами за несколько дней или недель до цветения. В качестве гаметоцидов используют – гидразид малеиновой кислоты, этрел, эпихлоргидрин глицерина, кальциевые соли ароматических кислот, метиловый эфир цис-2-метил-3-циклогексенкарбоновой кислоты, эфиры фталевой кислоты, 3-карбоксиацетидин и др. Термическую и химическую кастрацию проводят у культур с мелкими цветками и слабой дифференциацией тычинок и рыльца (просо, сорго, чумиза, злаковые травы). Гаметоциды уже используют для промышленного производства гибридов с целью использования эффекта гетерозиса.

Е.А. Родиным и В.В. Смирновым (1981) разработано устройство для гибридизации растений на основе использования электричества. Оно содержит источник высокого напряжения, коронирующий и осадительный электроды. Повышение эффективности кастрации в данном случае достигается за счёт создания сильно сконцентрированного радиального электрического поля вокруг зацветшей части растения. Коронирующий электрод выполнен в виде полусферы, переходящей в цилиндр, на внутренних поверхностях которого установлены радиально ориентированные металлические иголки.

Академиком ВАСХНИЛ Д.А. Долгушиным был предложен способ кастрации пшеницы, ячменя и ржи путём чеканки колоса (подстригания колосков ножницами). При использовании данного способа получаются очень мелкие гибридные семена. Н.М. Сатаров (1962), взяв за основу этот метод, заменил приём подстригания колосков ножницами на приём сдавливания их пинцетом. Пшеницу лучше кастрировать путём сдавливания пинцетом каждого цветка на уровне верхушек пыльников, рожь – путём сдавливания каждого колоска на уровне ниже середины пыльников. При этом достигается соответственно 95 и 98% кастрации и 54 и 70% завязывания семян. Производительность кастрации возрастает по пшенице в три, по ржи – в пять раз.

Метод чеканки колоса был уточнён Б.Г. Рейтером и Л.П. Россеевой (1990). Суть усовершенствования сводится к тому, что за 3–4 дня до цветения обрезают колоски на середине колосковых чешуй под углом 20–30º к прямой, параллельной основанию колоска и проходящей через его середину, обеспечивая достаточное повреждение пыльника и оставляя неповреждённым рыльце пестика.

Кастрация пшеницы может быть проведена путём стерилизации пыльцы парами летучих веществ (нафталин, керосин, дизтопливо). При заключении колосьев остистых сортов пшеницы на 48 ч, а безостых – на 72 ч под изоляторы, смазанные внутри керосином, достигается 97–99% гибели пыльников. Завязи при опылении дают 40–70% крупных жизнеспособных семян.

Как правило, в селекции применяют механическую кастрацию – удаление из цветков материнских растений недозрелых пыльников для того, чтобы на рыльце материнского цветка не попала собственная пыльца. Пыльники удаляют из цветка пинцетом, не повреждая столбик и рыльце. Для селекционных и генетических целей этот способ пока является наиболее надёжным.

Перед кастрацией планируют объём работ. Для этой цели предложена формула определения необходимого для кастрации и опыления количества колосьев (N) при получении запланированного числа гибридных зёрен (В.А. Зыкин, 1980) (4.5).

, (4.5)

где N – необходимое для кастрации и опыления число колосьев, шт.; G – планируемое число семян; Т – завязываемость, %; F – оставляемое при кастрации и опылении количество цветков в соцветии.

Например, по каждой комбинации запланировано получить не менее 200 гибридных зёрен, завязываемость гибридных зёрен составляет в среднем 60%, в колосе при гибридизации оставляется в среднем около 20 кастрированных цветков. Тогда необходимое для кастрации число колосьев по каждой гибридной комбинации составит: колосьев.

После кастрации с помощью специальных изоляторов из пергамента и других материалов проводят изоляцию соцветий или отдельных цветков. На изоляторе или этикетке, а также в журнале гибридизации пишут: номера прокастрированных соцветий (цветков), номер делянки материнской формы, дату кастрации, количество прокастрированных цветков и фамилию селекционера.

Через некоторое время после кастрации и изоляции цветков или соцветий проводят искусственное опыление материнских растений пыльцой отцовских форм. Опыление проводят с помощью кисточки (пинцета, пипетки) или другим методом в ранние утренние часы (с 6 до 10 ч), когда рыльце наиболее восприимчиво к пыльце. При проведении опыления кастрированных растений необходимо учитывать долговечность рылец пестиков материнских форм, а также пыльцевую продуктивность и жизнеспособность пыльцы у отцовских форм.

долговечность рылец у злаков варьирует от 5 до 14 сут у ржи, от 5 до 11 сут – у пшеницы и от 12 до 20 сут – у кукурузы. Долговечность рылец существенно зависит от влажности и температуры воздуха в момент гибридизации. При засушливой погоде долговечность рылец снижается, и опыление проводят раньше. Например, у пшеницы опыление обычно проводят через 2–5 сут после кастрации. Для снижения отрицательного влияния засухи на рыльца пестиков можно проводить опрыскивание изоляторов водой из пульверизатора.

Пыльцевая продуктивность в пределах рода зависит от уровня плоидности и генотипа. У диплоидных видов пшеницы число пыльцевых зёрен в цветке колеблется от 6027 до 12699, у тетраплоидных – от 5472 до 11088, у гексаплоидных – от 4320 до 10578. Соответственно опылённость рыльца (число пыльцевых зёрен на рыльце) цветка после опыления: 60–121, 24–67 и 22–120. Пыльцевая продуктивность одного цветка у Secale cereale достигает 57000, у Zea mays – 10000 пыльцевых зёрен.

Чем крупнее пыльник, тем больше пыльцы образуется. Так, у 26 сортов мягкой пшеницы его размеры колебались от 3,67 до 5,25 мм, число пыльцевых зёрен – от 2031 до 5094.

Озимая пшеница образует большее количество пыльцы по сравнению с яровой, поэтому её лучше использовать в качестве отцовского компонента при скрещивании с яровой пшеницей.

А.Н. Агеев с коллегами (1973) для повышения пыльцевой продуктивности растений предлагает перед посевом семена пшеницы обрабатывать 0,1%-ным раствором йодвисмуткомплексоната в течение 18 ч при 18–20ºС.

При нормальных условиях жизнеспособность пыльцы короткая (от нескольких минут до нескольких часов). При температуре –20ºС и влажности воздуха 25% пыльца сохраняет способность к прорастанию в течение нескольких месяцев. Кратковременно можно хранить при температуре около 0ºС. Например, при хранении пыльцы ржи в стеклянных стаканчиках на открытом воздухе она утрачивала способность к прорастанию в 30%-ном растворе сахарозы в течение суток, сохраняя её на рыльцах даже на четвёртые сутки. Пыльца пшеницы менее жизнестойка, чем ржи.

Для перекрёстноопыляющихся растений при свободном ветроопылении необходимо учитывать рассеивание пыльцы и сферу эффективного ветроопыления. Так, например, радиус и высота рассеивания пыльцы у ржи составляет соответственно 1600 и 1000 (2000) м, у кукурузы – 91,7 м. Данная информация имеет значение не только для селекции, но и учитывается в процессе семеноводства сортов перекрёстноопыляющихся культур (В.А. Зыкин, А.Х. Шакирзянов, 2001).

Большое значение для повышения эффективности гибридизации имеет совмещение сроков цветения родительских форм. Разницу во времени цветения материнских и отцовских компонентов устраняют несколькими путями:1) проводят посев родительских форм в разные сроки; 2) регулируют световой режим; 3) удаляют соцветия, чтобы вызвать регенерацию и продлить время цветения (подкашивание); 4) яровизируют позднеспелые сорта; 5) если скрещивают озимые сорта с яровыми, последние высевают под зиму, поздно осенью, или очень рано весной, в теплицах или вегетационных домиках.

Для совмещения сроков цветения разновременно цветущих сортов и продления процесса гибридизации в Самарском госуниверситете (Н.А. Егорцев, А.М. Медведев, Ю.Д. Царевский, 2002) разработан новый способ гибридизации пшеницы. Суть данного способа заключается в том, что срезанные стебли пшеницы помещают в питательный раствор и хранят в холодильнике при пониженной плюсовой температуре до проведения искусственного опыления. Питательный раствор содержит 25–30 г сахара, 5 г лимонной кислоты, 30 мг хлорамина и 5 кристаллов тимола на 1 л воды. После содержания в холодильнике срезанные стебли кастрируют и производят искусственное опыление в лабораторных или полевых условиях.

В селекции полевых культур применяют несколько методов опыления.

1. Принудительное опыление (классический метод). В каждый цветок пинцетом вкладывают по 1–2 зрелых пыльника. Пыльцу предварительно собирают в баночки или пакеты в день опыления во время массового цветения. Цветки материнского растения опыляются пыльцой одного отцовского растения. Этот метод применяют в настоящее время при гибридизации овса.

2. Краснодарский (групповой) метод (НИИСХ им. П.П. Лукьяненко). Материнское растение свободно опыляется пыльцой нескольких специально подобранных отцовских сортов (рис. 4.4).

Рис. 4.4. Схема Краснодарского метода опыления под общим изолятором

Пять-шесть кастрированных колосьев материнского сорта заключаются в один общий изолятор (20 х 35 см), в который через 3–5 дн. вводят вставленные в бутылку с водой колосья отцовского сорта (по 1,5–2 колоса на каждый материнский). Отцовские колосья должны быть выше материнских. Групповой метод позволяет повысить производительность труда при опылении и увеличивает количество завязавшихся зёрен.

3. Опыление методом сближения. При этом заранее подобранные для скрещивания родительские формы высевают смежными рядками. Кастрированные колосья материнского сорта помещают под общий изолятор с колосьями рядом растущего отцовского сорта. Недостатки этого метода: 1) сорта могут значительно различаться по продолжительности вегетационного периода; 2) материнские растения могут быть выше отцовских; 3) пары нужно подбирать заблаговременно.

4. «Твел» - метод разработан в СИММИТ. При использовании этого метода колосковые и цветковые чешуи обрезают очень коротко. Колосья отцовской формы (по одному на каждый материнский) ставят в банку с горячей водой. У них также низко обрезают колосковые и цветковые чешуи. Когда в отцовском колосе появятся пыльники из нескольких цветков, его вводят в открытый изолятор и несколько раз вращают.

Рис. 4.5. Устройство для опыления растений: 1 – камера; 2 – усечённый конус крышки камеры; 3 – изолятор; 4 – скрепка; 5 – упорное ограничительное кольцо; 6 – эластичные дуги (В.А. Зыкин, А.Х. Шакирзянов, 2001)

5. Камерный метод разработан В.А. Зыкиным и В.Ф. Куцом (1978). Он совмещает преимущества Краснодарского и «твел»-метода. Для опыления применяют камеру, представляющую собой картонный или сделанный из оргстекла цилиндр диаметром 8 см с отверстием в верхней части диаметром 4,0–5,5 см в виде усечённого конуса (рис. 4.5).

Высота цилиндра камеры 18 см. Отцовские растения при выбрасывании пыльников помещают в камеру через усечённый конус крышки. Камеру вводят до упорного ограничительного кольца в изолятор с материнскими колосьями так, чтобы отцовские колосья их не касались. При взаимодействии эластичных дуг кольца с отцовскими колосьями зёрна пыльцы с пыльников полностью сбрасываются, тщательно перемешиваются и попадают в цветки материнских колосьев, производя их опыление без повреждения.

6. Свободное ветроопыление (свободное неограниченное опыление) – материнское растение может свободно опыляться пыльцой всех произрастающих вокруг сортов и форм. Растения материнского сорта высевают посредине посева отцовского сорта. Проводят кастрацию подобранных материнских соцветий, остальные соцветия материнского сорта срезают. Опыление производится растущими вокруг растениями отцовского сорта.

После опыления на изоляторе и в журнале гибридизации пишут номер делянки отцовской формы, дату опыления и фамилию селекционера, проводившего опыление.

Гибридизация у перекрёстноопыляющихся ветроопыляемых и насекомоопыляемых культур, а также у двудомных и однодомных растений имеет некоторые особенности, связанные преимущественно с биологией их цветения и опыления.

У перекрёстноопыляющихся культур кастрацию проводят в тех случаях, когда аутостерильность встречается редко или не обнаруживается совсем. У ржи зрелые пыльники выходят из цветка ниже рыльца, поэтому пыльца на рыльце своего цветка не попадает. Кастрацию не проводят, а прямо опыляют колос одного растения пыльцой другого. Колос материнского растения сразу после выхода из трубки изолируют. Как только начинает зацветать отцовское растение, один из его колосьев подводится под изолятор, где и остаётся до конца созревания. Подведение отцовского колоса осуществляют путём подстановки сосудов (при выращивании в сосудах), путём подсадки (прикапывания) отцовского растения к материнскому или подсовывания в изолятор срезанного цветущего колоса. Отцовский стебель с корнем можно вставить в пробирку с водой, привязанную к материнскому колосу. К кастрации у ржи прибегают только при скрещивании с целью генетического изучения признаков. В СибНИИСХе цветки материнских форм ржи кастрируют путём подрезания цветка и находящихся в нём пыльников. Подобным образом скрещивают Тимофеевку.

Изоляция клевера производится путем надевания мешочка из батиста на соцветие через 2–3 дня после раскрытия бутонов. Кастрация не проводится. При опылении берут вполне расцветшую головку отцовского растения и при помощи заострённой спички переносят с неё пыльцу. Для этого концом спички нажимают на край лодочки, которая отгибается, освобождая пыльники. Проводя по последним краем спички, собирают на её конце пыльцу. Перенесение пыльцы происходит таким же образом.

У двудомных растений (конопля, хмель, шпинат, спаржа) из посева устраняют до цветения мужские растения материнского сорта, а остающиеся растения отцовского компонента используют для опыления. Их помещают под общий каркасный изолятор или обеспечивают пространственную изоляцию.

У однодомных растений с однополыми цветками удаляют мужские соцветия на материнских растениях, а опыление осуществляют пыльцой с отцовских компонентов.

Например, у кукурузы на материнском растении до цветения удаляют метёлку. На отцовском растении перед созреванием пыльцы срезают мужское соцветие и располагают его над початком материнского растения и надевают на них общий изолятор. Основание метёлки ставят в бутылку с водой, которую привязывают к стеблю кукурузы.

У насекомоопыляемых растений для изоляции кастрированных цветков или соцветий используют изоляторы, исключающие доступ к ним насекомых; у ветроопыляемых растений применяют плотные изоляторы.

Используют также посев родительских компонентов парами в разных местах, осуществляя пространственную изоляцию. Например, у свёклы вокруг родительских пар создают загущенный посев из высокостебельных культур (конопли). Компоненты скрещивания с разными сроками цветения могут быть высеяны вместе – в данном случае обеспечивается временная изоляция.

При скрещивании используют также пыльцевую стерильность материнских компонентов, что снижает затраты на механическую кастрацию.

Поиск по сайту: