ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Фотоколориметрический метод анализа белка основан на измерении оптической плотности белкового раствора, зависящей от его кон­центрации, температуры, интенсивности падающего света и природы ве­щества. Эта зависимость выражается основным законом светопоглощения - законом Бугера-Ламберта-Бера: D = lg (I₀ / I) = e · c · l, где D - оптическая плотность (экстинкция); I₀ - интенсивность падающего света; I - интенсивность прошедшего через раствор света; e - молярный коэффициент поглощения; c - концентрация вещества, моль/л; 1 - толщина слоя раствора, погло­щающего свет.

Биуретовый фотоколориметрический метод количественного определения белка в исследуемом материале основан на проведении биуретовой реакции. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству пептидных связей, а, следовательно, и концентрации белка в растворе.

Оптическая плотность измеряется на фотоэлектроколориметре (ФЭК), с устройством которого можно ознакомиться по инструкции, прилагаемой к прибору. По оптической плотности исследуемого раствора с помощью калибровочной кривой находят концентрацию белка в растворе.

Реактивы и оборудование: раствор стандартного белка, раствор исследуемого белка, биуретовый реактив, 0,9%-ный раствор хлорида натрия, ФЭК, кювета на 10 мм, пипетки мерные на 1, 2, 5 мл, колбы мерные на 100, 200, 500 мл, фильтровальная бумага.

Приготовление биуретового реактива.

В колбе на 200 мл растворяют 9 г сегнетовой соли, после растворения добляют 3 г сульфата меди и 1 г иодида калия и доводят до метки 0,2 н раствором гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют 300 мл 0,5%-ного раствора иодида калия.

Выполнение работы. При анализе яичного белка, белка сыворотки крови исследуемые растворы предварительно разбавляют 0,9%-ным раствором хлорида натрия (яичный белок в 50 раз, сыворотку крови - в 100 раз). Готовят серию (5-6) стандартных растворов белка с концентрациями 1 – 8 мг/мл. Разведение до необходимых концентраций белка осуществляют раствором, который использовали для разбавления исследуемого материала. В пробирки отбирают по 1 мл приготовленных стандартных растворов и добавляют 5 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают, оставляют на 30 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность (D) с помощью ФЭКа при 540 нм в кювете на 10 мм против контроля. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. По полученным значениям D строят калибровочный график в координатах D - f (c). Затем, измеряют аналогично оптическую плотность исследуемого раствора белка, смешав 1 мл исследуемого раствора и 5 мл биуретового реактива, и по построенной калибровочной кривой определяют его концент­рацию. Результат пересчитывают на 100 г продукта.

Контрольные вопросы.

1. Какие существуют методы количественного определения белков?

2. На чем основаны рефрактометрический и фотоколориметрический методы анализа белковых молекул?

3. В чем заключается принцип биуретового метода?

4. От чего зависят оптическая плотность и показатель преломления белковых растворов?

5. Для чего и как составляют калибровочный график?

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков.- М.: Высшая школа.-1996.

2. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: Высшая школа.- 1985.

3. Жура Н.А. Методическая разработка к изучению темы «Белковые аминокислоты».- Изд-во Могилевского гос. ун-та.-1999.

4. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. – Минск.-1976.

5. Филлипович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. - М.: Просвещение.- 1978.

6. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир.-1999.

7. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия.- М.: Высшая школа.-1996.

8. Березов Т.Т. Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.-М.: Медицина.-1998.

9. Р. Марри, Д. Греннер, П.Мейес, В. Родуэлл Биохимия человека.- М.: Мир.- Т.1,2.- 1993.

10. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение.- 1975.

11. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Щеголева Л.И. Упражнения и задания по биологической химии. - М.: Просвещение.- 1986.

Поиск по сайту: