Теоретическая справка. Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген- взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации:

1. Спонтанная (самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-форме, не дают гомогенной (однородной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не даёт спонтанной агглютинации.

2. В сыворотках здоровых людей имеются антитела к некоторым микроорганизмам (так называемые нормальные антитела). Титр этих антител не высок, по этому положительный результат реакции в разведении сыворотки 1:50 и выше говорит о её специфичности.

3. Наличие в сыворотке антител к бактериям (антигенам), близким по строению к изучаемым (так называемая групповая реакция). Например, сыворотка больного брюшным тифом может агглютинировать также бактерии паратифа А и В. В отличие от специфической, групповая реакция идёт в более низких титрах. Адсорбированные сыворотки освобождены от групповых антител и не дают групповой реакции.

4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесённого заболевания и даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются «анамнестическими». Чтобы отличить их от «инфекционных» антител, реакцию агглютинации ставят в динамике, т.е. исследуют сыворотку того же больного через несколько дней. Повышение титра антител говорит о наличии болезни - титр «анамнестических» антител не повышается, а может даже снизиться.

Существуют два основных метода поведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда их называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках).

СХЕМА №1

Методы постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция

коагглютинации Развернутая РА на

стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбировнлиые сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

СХЕМА №2

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум. Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

СХЕМА №3

При положительном результате реакции в пробирках видны склеившиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

++ осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции.

Цель:

1. Определить родовую принадлежность выделенной чистой культуры в ориентировочной РА на стекле с поливалентными сыворотками: сальмонеллезной ABCDE, шигеллезной, иерсиниозной (сероиндикация). Поставить, учесть, оценить результат РА.

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Определить вид исследуемой культуры в развернутой РА на стекле с

монорецепторными сальмонеллезными сыворотками: 09, 04, Ovi, 05, 012, 01, Hi, Hd HI,2 (сероидентификация). Поставить, учесть, оценить результат РА (см. теоретическую справку, таблицу №1).

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. Учесть результат РА с бруцеллезным диагностикумом с целью выявления антител в парных сыворотках больного (серодиагностика). Парные сыворотки - это сыворотки от одного и того же больного, взятые в начале болезни и через одну две недели с целью выявления нарастания титра антител. Сделать вывод. (См. схему № 3).

1-я неделя

2-неделя

1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Выполните задания для самоконтроля:

Агглютинация-это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ингредиенты для постановки РА:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Феномен реакции _____________________________________________________________

Поиск по сайту: