МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

1. В развивающихся куриных эмбрионах.

2. В организме чувствительных животных.

3. В культуре клеток.

По способу выращивания тканевые культуры можно разделить на следующие группы:

A) культуры переживающих тканей,

Б) культура стабильно растущих перевиваемых тканей (фиксированных),

B) однослойные первично трипсинизированные культуры тканей.

А) Культуры переживающих трансплантатов (метод Мейтландов)

Кусочки тканей, удаленной при операции медаборта размером 1-2 мм, отмывают в солевом растворе и помещают в плоскодонные колбы Эрленмейера с питательной средой (раствор Эрла +0,5% раствор гидролизата лактальбумина с добавлением антибиотиков). Вместо лактальбумина можно использовать ультрафильтрат бычьей сыворотки. При регулярной смене питательной среды ткань может оставаться жизнеспособной 1-2 недели.

Б) Культура стабильно растущих (фиксированных) трансплантатов

Кусочки ткани, поддерживаемой и перевиваемой в лаборатории, отмывают 3 раза в растворах Версена и Хенкса и помещают в питательную среду. Затем в пробирки вносят 2 капли куриной плазмы и эмбриональный экстракт. Вращательными движениями смешивают плазму и экстракт. При свертывании плазмы фиксируют кусочки ткани на стенках посуды, после чего через 1-2 дня вокруг них образуется новый слой клеток, а через 6-9 дней - ореол фибробластов.

Для поддержания роста применяют среду 199 или смесь фильтрованной коровьей сыворотки, крови, амниотической жидкости и солевого раствора Хенкса. Наиболее часто применяются линии клеток из нормальных тканей человека (конъюнктивы, печени, почек, аппендикса, слизистой носа, эпидермиса, миндалин). Нередко пользуются малигнизированными тканями из опухоли шейки матки (Hela), гортани (Нер-2) лимфатического узла (Нер-3), карциномы верхней челюсти (KB), из костного мозга больного раком легкого.

В) Однослойные трипсинизированные культуры клеток

Для их приготовления используют почку обезьяны, эмбриона человека, амниотическую оболочку последнего, ткань куриного эмбриона.

Измельченную до 2-3 мм ткань заливают 0,25 % раствором трипсина и оставляют при +4 С° на 18 часов или +37 С° на 3-4 часа. Затем в клеточную массу добавляют холодный раствор Хенкса, для прекращения процесса переваривания межклеточных связей. Клеточную взвесь фильтруют через 2-3 слоя стерильной марли, центрифугируют при 600 об/мин 20 мин. Осадок ресуспендируют в среде 199 с 10-15 % телячьей сыворотки или в растворе Хенкса с 0,5 % раствором гидролизата лактальбумина и 10-15 % сыворотки теленка. Клеточную взвесь (200000 клеток в 1 мл) разливают в сосуды для культивирования.

Сплошной монослой формируется через 4-5 дней и сохраняется после смены питательной среды 2-3 недели.

При использовании амниотической оболочки для ее измельчения берут раствор Версена на (0,02 %). Далее добавляют фосфатный буфер с 500-1000 ЕД пенициллина и 500-1000 ЕД стрептомицина на 1 мл среды. Затем выдерживают измельченную ткань 60 минут при +30 С° на водяной бане, декантируют, обрабатывают трипсином (0,25 % раствора) 60 минут. После промывания раствором Хенкса с 25 % человеческой сыворотки массу фильтруют через 2-х слойную марлю и ресуспендируют в питательной среде (до 300000 клеток в 1 мл). Культивирование производят 5-6 дней.

Поиск по сайту: