Теоретический материал. В проведенных ранее исследованиях было установлено, что взаимодействие гидрофобного лиганда хлороформа с гем-содержащим белком - цитохромом С

В проведенных ранее исследованиях было установлено, что взаимодействие гидрофобного лиганда хлороформа с гем-содержащим белком - цитохромом С, - при медленном установлении равновесия, в так называемых «мягких» условиях, приводит к формированию «голубого» сдвига в области пика Соре [1]. При этом было обнаружено, что воздействие слабым переменным магнитным полем ускоряет формирование указанного спектрального сдвига, на основании чего был сделан вывод об усилении связывания хлороформа с белками [2,3].

Для объяснения обнаруженных явлений было предложено два альтернативных механизма формирования спектральных сдвигов [1]. Первый предполагаемый механизм основывается на том, что хлороформ, связываясь с белком по гидрофобному механизму, оказывает денатурирующее действие на пространственную структуру молекулы белка, в результате чего открывается доступ полярным молекулам воды к хромофорам, исходно находящимся в гидрофобном окружении внутри белковой глобулы. Данный механизм основывается на общеизвестном факте о разрушающем действии хлороформа на биологические структуры.

Второе объяснение спектральных изменений также основывается на представлениях о том, что хлороформ связывается в гидрофобных полостях молекулы белка, однако сильного денатурирующего воздействия такое взаимодействие не оказывает, о чем свидетельствовали незначительное снижение активности фермента – цитохрома С, насыщенного хлороформом [1], а также данные других авторов, полученные на моделях с разными белками и разными углеводородами [3,4,5]. Поэтому в данном случае в качестве причины формирования «голубых» сдвигов предполагали частичную полярность молекулы хлороформа, характеризующуюся не нулевым дипольным моментом. Выяснение механизма взаимодействия гидрофобных низкомолекулярных веществ с белками требует проведения исследований на других белковых моделях использованием разных веществ гидрофобной природы. В связи с этим целью данной работы было проведение сравнительного анализа влияния хлороформа и бензола на спектры оптического поглощения гемоглобина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служил раствор гемоглобина в концентрации 3⋅10-5

М/л, который получен путем гемолиза эритроцитов. В данном исследовании, так же как и в ряде предыдущих работ [1,2], в качестве базовой экспериментальной модели было использовано явление насыщения растворов белка низкомолекулярными лигандами гидрофобной природы. Объектом исследования служил гемоглобин, насыщаемый хлороформом и бензолом. О связывании гидрофобных лигандов с белком судили по характерным изменениям спектра поглощения гемоглобина в области пика Соре. Насыщение растворов гемоглобина хлороформом и бензолом осуществляли в стеклянных бюксах путем наслаивания 3 мл раствора белка на 1,5 мл низкомолекулярного лиганда c последующей инкубацией образцов при комнатной температуре. Инкубацию образцов проводили в течение 2 часов, по окончании которой регистрировали интегральные спектры растворов гемоглобина, насыщенных хлороформом и бензолом. Дифференциальные спектры получали как разность между интегральными спектрами растворов нагруженного углеводородами и нативного белка.

Математическую обработку результатов проводили в соответствии с общепринятыми правилами вариационной статистики. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунке 1 представлены интегральные спектры поглощения гемоглобина в области поглощения гема 350-450 нм (полосы Соре) с максимумом оптической плотности в контрольных образцах на длине волны λmax = 415 нм. Как видно, насыщение раствора гемоглобина хлороформом приводит к снижению значений оптической плотности в области максимума поглощения в среднем на 5 %. Данное явление в литературе известно как гипохромный эффект [7]. Однако анализ дифференциальных спектров (рис. 2) показал, что на фоне общего снижения оптической плотности имеет место сдвиг пика Соре в область более коротких длин волн, что приводит к формированию «голубого» сдвига на дифференциальном спектре с характерным минимумом в области 418-420 нм. Подобное явление спектрального сдвига основной полосы поглощения гема в коротковолновую область при насыщении белка хлороформом было обнаружено ранее в исследованиях на модели с цитохромом С [1]. Поэтому данные, полученные в настоящем исследовании указывают на общие закономерности процесса взаимодействия хлороформа с белками, в частности с гем-содержащими.

Отдельный интерес представляет изучение взаимодействия бензола с гемоглобином, так как бензол, в отличие от хлороформа, характеризуется отсутствием дипольного момента, а также используется в качестве неспецифического лиганда, позволяющего оценить объем гидрофобных полостей белков [8]. Как видно из рисунка 1 при взаимодействии бензола с гемоглобином имеет место менее выраженное снижение оптической плотности в области пика Соре. Одновременно с этим отсутствие выраженного гипохромного эффекта позволяет четко регистрировать смещение полосы Соре в длинноволновую область в виде «голубого» сдвига с минимумом в области 420-422 нм (рис. 2).

Рис 1. Интегральные спектры водных растворов гемоглобина через 2 часа инкубации:

1- растворы чистого белка;

2- растворы белка, инкубированного с хлороформом;

3- растворы белка, инкубированного с бензолом.

Рис. 2. Дифференциальные спектры водных растворов гемоглобина через 2 часа инкубации:

1- растворы белка, инкубированного с хлороформом;

2- растворы белка, инкубированного с бензолом.

Рис. 2. Дифференциальные спектры водных растворов гемоглобина через 2 часа инкубации:

1- растворы белка, инкубированного с хлороформом;

2- растворы белка, инкубированного с бензолом.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что при насыщении гемоглобина хлороформом и бензолом происходит изменение параметров среды, окружающей гем. Согласно установившимся представлениям о спектральных сдвигах в биополимерах [7], «голубой» сдвиг связан с переходом хромофора в более полярную среду. Таковой для белков в первую очередь является полярный растворитель – вода. В работе [1] было высказано предположение о том, что одной из причин формирования «голубого» сдвига также может быть образование в гидрофобных полостях белковой молекулы слабополярной фазы хлороформа (дипольный момент молекулы хлороформа µхлороформ = 1.06 D). Однако, в экспериментах с бензолом также регистрируется «голубой» сдвиг, что тоже указывает на усиление взаимодействия гема с полярной фазой. Следует заметить, что молекула бензола связывается в гидрофобных полостях белковых молекул, но имеет нулевой дипольный момент. Основываясь на этих фактах, можно сделать вывод о том, что в обоих случаях «голубой» спектральный сдвиг в исследуемых модельных условиях формируется в результате усиления взаимодействия гема с полярными молекулами воды. Об этом также свидетельствует сходство основных параметров дифференциальных спектров (табл.). Связывание углеводородов и их производных в гидрофобных полостях белковых молекул индуцирует изменения пространственной структуры макромолекулы и тем самым открывает доступ молекулам воды к внутренним гидрофобным полостям, в которых располагаются порфириновые структуры.

Таблица

Поиск по сайту: