Аннотация и методика проведения лабораторных работ

Работа №1. Отделение плазмы от форменных элементов крови и определение их объемного соотношения.

Кровь состоит из плазмы и взвешенных в ней форменных элементов эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. В норме кровь взрослого человека содержит 52-58% плазмы и 42-48% форменных элементов. Это соотношение у человека меняется в зависимости от функционального состояния организма, а так же при ряде заболеваний. Для определения соотношения объемов плазмы и форменных элементов кровь центрифугируют в градуированном стеклянном капилляре с делениями от 0 до 100­ – гематокрите. После центрифугирования определяют высоту столбика форменных элементов.

В последнее десятилетие в соответствии с Международной системой СИ чаще указывается общий объем эритроцитов в литрах на литр (л/л), т.е. так называемая гематокритная величина.

Проведение работы:

а) отделение плазмы от форменных элементов путем центрифугирования 10 мл крови собаки, набранной из ее бедренной вены в стеклянную градуированную пробирку, на дно которой предварительно наливается небольшое количество лимоннокислого натрия для предотвращения свертывания. Пробирку с кровью помещают в центрифугу: плотно закрывают ее крышкой, плавно при помощи реостатов включают мотор и центрифугируют в течении 10-15 минут при 2500-3000 об/мин.

После центрифугирования, вследствие различного удельного веса плазмы и форменных элементов, в верхней половине пробирки собирается соломенно-желтого цвета плазма (уд. вес - 1,030), а в нижней части ­форменные элементы (уд.вес - 1,090). Над красным столбиком эритроцитов хорошо видна белесовато-серого цвета пленка, состоящая из лейкоцитов.

б) относительный объем форменных элементов и плазмы в капле крови определяют с помощью микроцентрифуги МЦГ-3.

Микроцентрифуга МЦГ-3 предназначена для определения гематокритного числа в 24 пробах. Она состоит из корпуса, вращающегося ротора, крышки, электродвигателя, задатчика времени. К центрифуге прикладываются капилляры одноразового пользования, герметизирующий состав для закупоривания капилляров и отсчетная шкала для определения гематокритного показателя крови.

Проведение работы:

1. Наполнить капилляр кровью из пальца (примерно на 7/8 его длины, поднося его к проколу).

2. Закупорить капилляр герметизирующим составом, для чего наполненный кровью конец капилляра быстро вдавить в состав на 3-4 мм. Таким же образом закупорить второй конец капилляра.

3. Установить закупоренные капилляры в пронумерованные гнезда подставки.

4. Отцентрифугировать в течение 10-15 минут, затем наложить отсчетную шкалу, совместить «0» отметку с границей крови в исследуемом капилляре, а линию «100» с внешней границей плазмы.

5. Затем повернуть отсчетную шкалу так, чтобы деление совместить с исследуемым капилляром и определить гематокритный показатель крови.

Работа №2.Определение количества эритроцитов.

Количество форменных элементов крови обычно принято выражать их числом в 1 мкл крови. У здорового человека это число является относительно постоянным. Количество эритроцитов у мужчин равно (4,0-5,1)х10⁶, у женщин (3,7-4,7)х10⁶, у новорожденных (4,5-7,5)х10⁶ в 1 мкл крови, а в литре у мужчин (4,0-5,0)x10¹², у женщин (3,7-4,7)х10¹². Подсчет форменных элементов производится: а) в счетных камерах; б) фотоэлектрических эритрогемометрах; в) в гематологических анализаторах.

а) Счетная камера с сеткой Горяева представляет собой толстое предметное стекло, при помощи желобков разделенное на 3 пластинки, из которых средняя на 1/10 мм ниже двух крайних (Рис. 1). Если на крайние пластинки положить покровное стекло, то между ним и средней пластинкой образуется щель - камера высотой 1/10 мм. Средняя пластинка, в свою очередь, желобком разделена на две половинки и на каждой из них нанесена сетка, которая состоит из 225 больших квадратов (15 на 15); каждый третий квадрат разделен дополнительно поперечными и продольными линиями на 16 маленьких; сторона маленького квадратика равна 1/20 мм. Следовательно, его площадь равна 1/400 мм². Объем пространства над маленьким квадратом равен 1/4000 мм³, т.к. высота камеры 1/10 мм (а объем жидкости ­1 мкл).

Проведение работы: счетную камеру тщательно вытирают салфеткой, помещают под малое увеличение микроскопа, отыскивают сетку и внимательно ее рассматривают.

Разведение крови: В предварительно высушенную чистую пробирку точно отмеривают 4 мл 3 % раствора хлористого натрия. Капиллярной пипеткой от гемометра Сали набирают 0,02мл (20 мкл) крови без пузырьков воздуха и осторожно выдувают ее в раствор хлористого натрия. Полученное разведение равно 1:200. Взвесь тщательно перемешивают, набирают в капиллярную пипетку и заполняют камеру.

Заполнение камеры: к счетной камере сбоку подводят покровное стекло и плотно его притирают до появления ньютоновских колец. Слегка надавливая на резиновую трубку, удаляют из капилляра 2 капли крови на ватный тампон. Затем к краю покровного стекла подносят кончик капилляра и выпускают каплю разведенной крови в счетную камеру.

Счетную камеру помещают по микроскоп и считают эритроциты в пяти больших квадратах (80 маленьких), расположенных по диагонали. Начинают счет с первого разделенного левого верхнего квадрата. В каждом большом квадрате подсчет эритроцитов ведут в маленьких квадратиках отдельно, начиная с верхнего ряда слева направо, во втором ряду квадратов - справа налево, затем слева направо и, наконец, в четвертом ряду - снова справа налево. В каждом маленьком квадрате считаются эритроциты, лежащие внутри квадрата, а также эритроциты, расположенные на границах между квадратами. Чтобы не сосчитать один и тот же эритроциты дважды, пограничные эритроциты считают только на двух границах (верхней и левой).

Количество эритроцитов в 1 мкл крови вычисляют следующим образом: определяют количество эритроцитов в одном маленьком квадратике. Для этого сосчитанные эритроциты (А) в пяти больших квадратах делят на 80 маленьких квадратиков, так как в каждом большом квадратике 16 маленьких A/80. Объем жидкости над одним маленьким квадратиком равен 1/4000 мкл. Следовательно, количество эритроцитов в 1 мкл крови равно:

А: 1 = А х 4000

80 4000 80

Полученное количество эритроцитов умножают на разведение, т.е. на 200. Формула для вычисления количества эритроцитов, следующая:

Количество эритроцитов в 1 мкл крови равно: Ах 4000 х 200,

а в литре крови = А х 4000 х 200 х 1000000

б) Определение количества эритроцитов при помощи фотоэлектрического эритрогемометра.

Принцип работы эритрогемометра следующий. Пучок света, проходящий через светофильтр и взвесь эритроцитов, попадает на фотоэлемент, фототок обратно пропорционален оптической плотности взвеси. Фототок смещает стрелку микроамперметра.

Проведение работы: в пробирку наливают 15 мл 3 % раствора хлористого натрия и добавляют 0,02 мл крови и тщательно перемешивают. Разведенную кровь наливают в кювету и помещают ее на место светофильтра «У», стрелка микроамперметра сместится от нуля. Нажав кнопку, вращают ручку установочного диска до возвращения стрелки на нулевую отметку. По шкале считают количество эритроцитов.

в) Гематологический анализатор - предназначен для автоматизированного исследования ряда показателей крови. Все операции

подключения, запуска и отключения контролируются микропроцессором через команды, подаваемые оператором с клавиатуры. Для исследования берется всего одна капля крови. Имеется графический принтер с возможностью подключения его на узкие бланки.

Изучаемые параметры и методы измерения.

1. Подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов (импедансный метод - измерение сопротивления, оказываемого клеткой в силовом поле низкочастотного тока).

2. Определение объема клеток.

3. Определение гематокрита через эритроцитарный объем.

4. Определение содержания гемоглобина (модифицированный гемоцианидный метод).

5. Дифференциальная гистограмма лейкоцитов (в абсолютных величинах и процентах) и другие характеристики форменных элементов крови.

Изучаемые показатели и их индексы (обозначения)

на гематологических анализаторах

Поиск по сайту: