Белковые гидролизаты в качестве добавок к косметическим препаратам

Очевидно, что некоторое количество белков присутствует в композициях, содержащих природные масла, в которых они содержатся в следовых количествах. Однако, как уже отмечалось выше, высокомолекулярные белковые молекулы не могут служить источником аминокислот для клеточных систем кожи.

Таким образом, мы столкнулись с явной недооценкой необходимости включения аминокислот в косметические композиции в качестве питательных ингредиентов. Однако, если мы стремимся создать косметические средства, обладающие действительной, а не мнимой питательной ценностью, то введение аминокислот в их составы представляется крайне необходимым.

Альтернативным вариантом конструирования косметических композиций, обладающих питательной ценностью, является введение в их составы белковых гидролизатов. Естественным было воспользоваться сведениями, полученными в процессе становления клеточной биотехнологии, и, в частности, в области конструирования питательных сред на основе белковых гидролизатов^*).

^*)Сведения любезно предоставлены М.П.Богрянцевой.

Обычно гидролиз белкового сырья проводят химическим или ферментативным способом, а в некоторых случаях комбинацией указанных методов. Химический метод гидролиза (как правило, кислотный) имеет ряд существенных недостатков: жесткие условия проведения процесса, частичное или полное разрушение некоторых аминокислот и их рацемация, протекание побочных процессов, дающих гуминовые вещества и токсичные примеси. Так, при этом имеет место частичное или полное разрушение триптофана, цистина, аланина, лейцина и образование значительного количества низкомолекулярных аминов и аммиака, что приводит к необходимости введения в технологическую схему дополнительных стадий очистки и удорожанию готового продукта [24].

Более перспективным считается ферментативный способ гидролиза, при котором исчезает необходимость нейтрализации кислот и удаления большого количества образующихся солей, а конечный продукт содержит значительно меньше гуминовых веществ. При ферментативном гидролизе белков наряду со свободными аминокислотами образуются пептиды, обладающие ростстимулирующей активностью [25, 26], что открывает возможность использования ферментативных гидролизатов в производстве бессывороточных и малосывороточных ПС [27]. Недостатком этого метода является невысокая степень гидролиза. Поэтому при гидролизе белков высокие требования предъявляются к ферментным препаратам [25, 28]. Дальнейший прогресс в производстве гидролизатов предполагает повышение качества и расширение номенклатуры ферментных препаратов с высокой протеолитической активностью [25].

Впервые среда на основе ферментативного гидролизата лактальбумина (ГЛА) была предложена в 1952 г. Мельником и Риорданом для культивирования клеток почки обезьян [29]. Среда на основе ГЛА и солевого раствора Хэнкса или Эрла проста в изготовлении, характеризуется высокими ростовыми свойствами, используется для получения широкого спектра клеточных культур и является одной из самых распространенных в вирусологической практике [30, 31]. Гидролизат лактальбумина получают ферментативным гидролизом белков молока. Он содержит в своем составе 18 аминокислот, в том числе и те, которые необходимы для культивирования клеток. ГЛА изготавливается фирмой Дифко (США) и импортируется в Россию.

Успех применения гидролизата лактальбумина послужил основанием для разработки отечественных гидролизатов из белоксодержащего сырья как животного, так и растительного происхождения.

Так, в настоящее время разработаны и внедрены в производство ряд ферментативных гидролизатов: ГСБМ - ферментативный гидролизат белков сыворотки молока, ФГМ-С - гидролизат мышечных белков ферментативный сухой, ГБ-С - ферментативный гидролизат белков сои и СБГ - ферментативный гидролизат белков гороха. Данные гидролизаты содержат 13-18 аминокислот, в том числе все аминокислоты, требуемые для клеточных систем, и пептиды, а ГСБМ, кроме этого, лактозу, что позволяет снизить расход глюкозы при изготовлении сред [32, 33, 34,35].

Испытание ростобеспечивающей способности ПС на основе ГСБМ показало возможность ее широкого применения для культивирования без предварительной адаптации как первичных культур, так и диплоидных штаммов ЛЭК (легкое эмбрионов коровы), СТ (сердце теленка), СЯ (сердце ягненка), ЩС (щитовидной железы свиньи) и постоянных клеточных линий СПЭВ, МДВК [33, 36]. При этом было отмечено, что использование указанных сред позволяет снизить содержание сыворотки в составе ростовой ПС до 1% при культивировании линии клеток щитовидной железы свиньи (ЩС). Промышленное производство ГСБМ осуществляется на НПО "Углич".

Гидролизат ФГМ-С, полученный путем ферментативного гидролиза мышечной ткани крупного рогатого скота или свиней, содержит в своем составе не менее 18 аминокислот, в том числе незаменимые, суммарное количество которых составляет 63-69%, что в 1,2-1,5 раза превышает их содержание в ГЛА и позволяет использовать гидролизат в рабочей концентрации не более 0,25-0,3% [37]. Питательная среда на его основе с 5-10% сыворотки КРС рекомендована для получения целого ряда клеточных культур. Промышленное производство ФГМ-С осуществляется на Щелковском биокомбинате [32]. Замена ГЛА на ФГМ-С позволяет снизить стоимость как ПС, так и производимых на ее основе культуральных биопрепаратов [37]. Однако, существенным недостатком способа получения ФГМ-С является использование в качестве белоксодержащего сырья мышечной ткани крупного рогатого скота, являющегося пищевым продуктом.

В настоящее время для производства белковых гидролизатов проводятся исследования по изысканию и использованию нетрадиционного сырья: шрота сои, гороха, подсолнечника [38, 39], отходов мясной, молочной, рыбной, птицеперерабатывающей промышленности (казеин, кормовые дрожжи, кровь и кровезаменители), а также отходов вакцинно-сывороточного производства [25, 40, 41, 42]. В частности промышленным способом были изготовлены ферментативные гидролизаты белков гороха и сои и использованы для изготовления питательных сред, пригодных для выращивания первичных и перевиваемых клеток [38, 39].

Рядом авторов предлагается к использованию ПС на основе ферментативных гидролизатов белков мышечной ткани плодов коров и свиней (ФГОМП), являющихся отходами мясоперерабатывающей промышленности [43]. Указанные среды, обогащенные комплексом витаминов (0,00011%), глутамином, пролином, тирозином (по 0,025%) и 4-6% сыворотки крови молодняка оленей, не уступали по составу синтетической среде 199. Следует, однако, отметить, что дефицитность исходного сырья и необходимость введения дополнительных компонентов затруднят изготовление гидролизата в больших объемах.

Из отходов мясоперерабатывающей промышленности предлагается также получать сухой белковый концентрат - СБК, используемый ранее только для микробиологических целей [44]. В настоящее время показана перспективность его использования в качестве основы ПС для культивирования различных видов клеточных линий [45].

Из непищевого сырья и отходов зверобойного промысла рядом авторов получены ферментативные гидролизаты и ПС на их основе: из мышц ластоногих - ПС "Целат"; из спила шкур ластоногих и/или шкур КРС - ПС "Эпедермат" [43]. Указанные среды содержат в своем составе 17 аминокислот, что соответствует содержанию аминного азота в ПС 199, обладают высокими ростстимулирующими свойствами и пригодны для получения ряда первичных, а также перевиваемых культур клеток животных и человека, в частности, перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA. Полученные результаты позволяют рекомендовать их для производства больших количеств клеточной биомассы вместо синтетической среды 199 [43, 46].

На основе обезжиренной мозговой ткани КРС, являющейся отходом производства медицинского препарата "Липоцеребрин", была разработана технология получения ферментативного гидролизата и ПС на его основе "Церебрат". Серийный выпуск "Липоцеребрина" обеспечивает стабильное получение больших количеств белкового сырья, что делает экологически чистым и безотходным производство медицинского препарата. ПС "Церебрат", содержащая 0,15-0,20% ферментативного гидролизата, обогащенная комплексом витаминов и 5% сыворотки крови КРС, по своим ростстимулирующим свойствам идентична среде 199 и пригодна для культивирования перевиваемых линий клеток почки человека RH-PA и СПЭВ, диплоидных штаммов М-19 (фибробластов человека) и ЛЭК (легкого эмбриона коровы). Авторами отмечено, что строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров процесса позволяют получать стандартный препарат, имеющий разброс количественных показателей аминокислот на уровне 5-6% [47].

Из отходов производства сыров и лактозы на молочных комбинатах, а также отходов гриппозной вакцины были получены сухие ферментативные гидролизаты, по своим физико-химическим свойствам близкие к ГЛА [48]. ПС, приготовленные на их основе оказались пригодными ля культивирования клеток почек сирийского хомячка (ПСХ), куриных фибробластов (ФЭК) и фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ).

Их отходов гамма-глобулинового производства был получен ферментативный гидролизат белков крови. ПС, приготовленная на его основе, обеспечивала рост культур клеток фибробластов эмбрионов кур, человека и мыши, почек сирийских хомяков [49].

Из отходов производства гриппозной вакцины - ткани куриных эмбрионов (КЭ) - был получен кислотный гидролизат, который оказался пригодным для получения ПС и выращивания линий клеток ВНК-21 и Vero [50].

Отечественная промышленность выпускает для лечебных целей кровезаменители и средства для парентерального питания аминопептид и гидролизин, являющиеся, соответственно, ферментативным и кислотным гидролизатами крови КРС. Указанные препараты содержат полный набор аминокислот, пептидов, изготавливаются в соответствии с требованиями ФС и поэтому обладают высокой стандартностью [25]. Аминопептид входит в состав ростовых сред и успешно используется для получения первичной культуры клеток мышиных фибробластов [31], а также перевиваемой линии почки теленка ПТ-80 и производства вакцинных препаратов [51].

В литературе имеются сведения о широком применении ферментативного гидролизата казеина в качестве аминопептидной основы для получения ПС, используемых в вирусологической практике для производства культур клеток и вирусов (см., например, [26, 39]). Гидролизат казеина содержит 10 из 14 необходимых для клеток аминокислот, а также пептиды, выполняющие роль сывороточных факторов, что делает возможным использование ферментативного (панкреатического) гидролизата казеина (ПГК) для культивирования клеток млекопитающих и в качестве перспективного заменителя сыворотки крови [26, 28] и др.. В этом случае в состав ПС вводят ПГК - 0,3%, комплекс витаминов, недостающие аминокислоты (аргинин, глутамин, триптофан, цистин), концентрацию сыворотки снижают до 1-2%, а для достижения требуемой вязкости в состав ПС дополнительно вводится 0,2% поливинилпирролидона. Использование ПС на основе ПГК позволяет снизить концентрацию сыворотки крови КРС или эмбриональной сыворотки в 5-10 раз и обеспечить интенсивную пролиферацию суспензионных клеток ВНК-21, лимфоидных клеток Namalva и МТ-4. Заменитель сыворотки, состоящий из ПГК и высокомолекулярного пирролидона, успешно апробирован в практике в составе малосывороточных ПС и рекомендуется для культивирования перевиваемых линий CHO-KI, Vero, L-929 и HeLa, а также гибридом человека G₁₀C₃ и G₁₀A₁, выращиваемых обычно только на богатых по составу средах с эмбриональной сывороткой [52].

Использование белковых гидролизатов для замены или частичного снижения сыворотки в составе ростовых ПС в последние годы находит все большее применение [26, 39]. Так, например, из отходов молочной продукции методом ультрафильтрации получают концентрат сывороточных белков молочной сыворотки, который используют в качестве ростовых факторов при культивировании линий HeLa и мышиных фибробластов, заменяя сыворотку крови КРС полностью или снижая ее концентрацию до 0,5-1% [53]. Определенный интерес заслуживает возможность использования гидролизатов из биомассы дрожжей, биомассы хлореллы (ФГБХ) [54] и ферментолизата биомассы организмов некробактериоза животных [51]. ПС, приготовленная на основе ФГБХ, не уступает по своим ростовым свойствам среде RPMI-1640, но в то же время позволяет снизить концентрацию сыворотки в 10 и более раз [55].

При разработке ПС для каждой отдельно взятой линии клеток рекомендуется индивидуальных подбор оптимальных условий: степени очистки гидролизата, концентрации в ПС, необходимость обогащения ПС вспомогательными компонентами. Так, например, для линии клеток почки сайгака, хорошо размножающейся в статических и роллерных условиях в среде Игла с 5-10% сыворотки крови КРС, при смене среды на гидролизатные, содержащие ГЛА, ГБК-С и ФГМ-С, изменяется морфология культуры клеток и чувствительность к вирусам.

Таким образом, за последние 10-15 лет в клеточной биотехнологии сформулировано и интенсивно развивается направление, связанное с конструированием питательных сред, содержащих в качестве аминокислотно-пептидной питательной компоненты гидролизаты белкового сырья.

Разработчикам косметических препаратов, в основном, еще только предстоит осознать необходимость введения аминокислот в качестве питательной составляющей в кремовые композиции, а затем, вне всякого сомнения, можно ожидать экспансии и в использовании белковых гидролизатов. Особенно привлекательным выглядит совмещение функций белковых гидролизатов. С одной стороны, это источник индивидуальных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, определяющих питательную ценность косметической композиции. С другой стороны, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что пептидная составляющая, по крайней мере, в некоторых видах белковых гидролизатов может обладать способностью ускорять клеточное деление, то есть - регенерирующим действием.

Имеется также информация о том, что среди веществ пептидной природы встречаются не только стимуляторы клеточного роста, но и вещества, способные ингибировать деление клеток (теория кейлонов). Поэтому представляется целесообразным при отборе белковых гидролизатов в качестве возможного сырья для косметической промышленности внимательно изучить и учесть экспериментальные данные, накопленные в клеточной биотехнологии, вирусологии и цитологии.

Однако, по нашему мнению, существует некоторое особое обстоятельство, которое также может отразиться на рекомендациях по косметологическому применению белковых гидролизатов. Вначале процитируем фрагментарно текст рекламного листа НПФ "ЛитА-Цвет", описывающему косметическую серию, препараты которой содержат "биологический стимулятор регенерации тканей "эксолин". "Эксолин": содержит биокомпоненты как высокой, так и низкой молекулярной массы", фактически являясь гидролизатом коллагенового сырья. Относительно роли коллагена, "молодого коллагена", "элластичного коллагена" и т.п. определений так много "накручено" и не только в рекламных буклетах, но и в научных трудах, что, учитывая действительную важность этого вопроса, мы посвятили его рассмотрению специальный раздел (см. гл.9). Поэтому сейчас предлагаем зафиксировать свои сомнения в целесообразности использования в косметологии любых сырьевых источников коллагенового происхождения, способных отвлекать фермент коллагеназу, локализованную в зоне расположения коллагеновых нитей, от основного ее предназначения - взаимодействия с коллагеновыми структурами человеческой кожи. Кажется, что такого рода соображения могут быть сформулированы в виде очередного парадокса. Однако предлагаю перенести его фиксацию в главу (гл.9), в которой рассматриваются, на наш взгляд, основные механизмы старения кожи.

Поиск по сайту: