Порядок работы с микроскопом

1.Проверить состояние осветительного аппарата (поднять кон­денсор, открыть его диафрагму, поставить плоское зеркало).

2.Положить на столик микроскопа исследуемый препарат и поставить слабый сухой объектив (8x) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния (для данного объектива 5-7 мм).

Рис.1 Дрожжевые клетки объектив 8x

Рис.2 Дрожжевые клетки объектив 40x

Рис.3 Дрожжевые клетки объектив 90x

3. Глядя в окуляр и вращая зеркалом, произвести предварительную установку освещения,

4. Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата. При использовании слабого сухого объектива в поле зрения, кроме препарата, может быть видно изображение источ­ника света, т.е. оконной рамы и других предметов, находящихся за окном.

5.Движением зеркала поставить в центре поля зрения наиболее светлый участок оконной рамы (например, участок неба с облаками), после чего можно переходить на микроскопию с сильным сухим или иммерсионным объективами. При этом мешающие детали исчезают из поля зрения, Если этого не происходит, то следует осторожно приподнять или опустить конденсор на 1-1,5 мм.

6.Поставив сильный сухой или иммерсионный объектив, ни в коем случае нельзя опускать тубус микроскопа, глядя в окуляр. Необходимо под контролем глаза, глядя сбоку, опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего, а затем, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока появится мелькание препарата. После этого точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону. При фокусировке микроскопа полезно левой рукой слегка двигать препарат по поверхности предметного столика.

§ 3. Пользуясь изложенными сведениями, необходимо научиться быстро и правильно устанавливать препарат в Фокусе при всех трех объективах. Рассматривая препарат, следует обратить внимание на резкое увеличение числа разрешаемых подробностей при работе с иммерсионным объективом по сравнению с сухими объективами.

Зарегистрировать рабочий номер своего микроскопа и указать в таблице его основные параметры.

Рис.4. Микроскоп Обозначения: 1 - окуляр; 2 - тубус; 3 -штатив(колонка и ножка);4- макрометрический винт; 5- микрометрический винт;6- зеркало; 7 - конденсор;8- предметный столик;9- объектив; 10 – револьвер.

Параметры рабочего микроскопа.

Тип (марка)__________________________________________________

Заводской номер_____________________________________________

Увеличение окуляра__________________________________________

Номера объективов: 8x________________________________________

40x_______________________________________

90x_______________________________________

Нумерическая апертура

объективов: 8x________________________________________

40x_______________________________________

90x_______________________________________

Общее увеличение

с объективом 90x_______________________________________

Порядковый номер________________________________________

Роспись_________________________________________________

§ 4. Необходимо твердо усвоить основные приемы бактериологической техники: обращение с культурами микробов, использование бактериологической петли, спиртовок, способы обеззараживания использованного материала и отработанных стекол.

При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать следующие два основные принципа: 1 - не загрязнить микробами окружающей среды и не заразить самого себя и 2 - не загрязнить культуру посторонними микробами из окружающей среды, так как точная идентификация исследуемого возбудителя заболевания возмож­на лишь при условии выделения и сохранения его в чистой культуре.

Культуру бактерий сохраняют обычно на жидких и плотных питательных средах в пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками. При всех манипуляциях с культурой (приготовление мазка, пересев ее с одной среда на другую и т.д.) используют стерильную бакте­риологическую петлю из металлической проволоки. Правильно приготовленная петля диаметром от I до 5 мм должна быть полностью замкнута и не должна тлеть лишнего свободного конца. Петлю стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки, держа ее сначала вертикально, затем проводят 3-4 раза через пламя прилегающую к петле часть петледержателя.

Для соблюдения вышеуказанных принципов в случае приготовления бактериологическую петлю берут в правую руку как ручку или карандаш, а пробирку держат в левой руке между большим и указательным пальцами с тыльной стороны кисти почти в горизонталь­ном положении. При этом должна быть хорошо видна поверхность питательной среды с культурой бактерий.

Простерилизовав петлю, правой рукой захватывают пробку, прижимая ее мизинцем к ладони, освобождают ее небольшим поворотом, вынимают над пламенем горелки и, не выпуская пробку из руки (в таком положении она сохраняется в течение последующих манипуляций) обжигают края пробирки. Петлю вводят в пробирку, остужают прикосновением к внутренней стороне стекла и берут ею небольшое коли­чество культуры, стараясь не захватить при этом питательной среды. Вынув петлю, опять обжигают края пробирки, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку. Не выпуская петли из руки, ставят пробирку в штатив и приступают к приготовлению мазка. После этого пет­лю стерилизуют и ставят в штатив.

С соблюдением этих основных правил производят и все другие манипуляции с культурами бактерий - пересев из пробирки в пробирку» из пробирки в чашку, из чашки в чашку и т.п.

В случае попадания культуры микробов на руки, другие предметы и пол необходимо немедлено протереть руки и загрязненные предметы ватой, смоченной дезинфицирующим растворов, а пол залить этим же раствором. Через 30 минут руки можно вымать с мылом.

§ 5. На чистое сухое предметное стекло нанести с помощью бактериологической петли каплю воды. Прокаленной и остуженной петлёй внести в небольшое количество (одну петлю) микробной массы и равномерно перемешать с водой. Петлю прокалить и поставить в штатив. Накрыть каплю чистым покровным стеклом и придавить его слегка рукояткой петли. Полученную "раздавленную каплю" поместить на предметный столик микроскопа и промикроскопировать сначала со слабым сухим объективом, затем с сильным сухим объективом и, наконец, с иммерсионным. Для установки препарата в фокусе следует найти вначале при малом увеличении капли, вывести его в центр поля зрения и затем по нему ориентироваться.

При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, что достигается опусканием конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы,

§ 6. На чистое предметное стекло наносят каплю воды и рядом с ней несколько больших размеров каплю туши. В каплю воды вносят небольшое количество исследуемой культуры (получается облачко помутнения). Прокалив и остудив петлю(чтобы сжечь оставшуюся массу бактерий), готовят равномерную взвесь бактерий. Затем соединяют эту каплю с каплей туши, тщательно перемешивают и размазывают по стеклу тонким слоем. Высушивают мазок на воздухе и микроскопируют с иммерсионным объективом.

При микроскопии препарата рекомендуется начинать с более светлых участков его, а затем переходить на более темные. Необходимо помнить, что при негативных способах окраски микробы остаются не убитыми.

§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, то он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цветов.

Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специаль­ными (светящимися) люминесцентными красителями - флуорохромами (например, раствор акридинового оранжевого 1:5000 - 1:10000). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускаются через сине-фиолетовый фильтр. Под действием

Рис.5 Стрептобацилла (“Раздавленная капля”)

Рис.6 Негативная окраска по Бури; объектив 90x

Рис.7 Люминесценция дрожжей, обработанных акридиновым оранжевым; объектив 40x

Рис.8 Оптическая схема люминесцентного микроскопа

этого коротковолнового излучения окрашенные акридиновым оранжевым бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызывающий люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром микроскопа ставят "запирающий" желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающие желтые, зеленые и красные лучи.

В результате при наблюдении в микроскопе на темном фоне будут видны микробные клетки, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. При окраске акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом, а находящаяся в цитоплазме рибонуклеиновая кислота - красным цветом.

Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными растворами красителей, не причиняющих вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с большим эффектом может -быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.

Флуоресцирующими красителями можно обрабатывать диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенным бактериям. Краситель, например, изотиоцианат флуоресцеина, химически соединяется с глобулинами иммунной сыворотки и таким образом как бы избиратель­но метит антитела.

Люминесцирующие сыворотки могут быть использованы для идентификации выделенных культур бактерии и для ускоренной индикации патогенных микробов во внешней среде и в выделениях больных.

Сущность иммунофлуоресцентного метода исследования заключается в том, что из исследуемого материала готовят мазок и после высушивания и фиксации обрабатывают его люминесцирующей сывороткой (см. занятие 12). При наличии в исследуемом мазке гомологичных бактерий, вследствие адсорбции на них меченных флуоресцирующим краси­телем антител, в люминесцентном микроскопе на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Центральная часть клеток не светится. Присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.

Демонстрация в люминесцентном микроскопе бактерий, обработан­ных акридиновым оранжевым и люминесцирующей сывороткой.

Контрольные вопросы

От чего зависит разрешающая способность микроскопа?

Почему иммерсионные объективы имеют более высокую разрешающую способность по сравнению с сухими объективами с тем же отверстным утлом?

Что такое нумерическая апертура и по какой формуле она определяется?

Чему равны разрешающая способность современных оптических микроскопов и их полезное увеличение?

На какой высоте должен находиться при микроскопии конденсор?

Каким зеркалом следует пользоваться при работе на микроскопах, снабженных конденсором?

Чему равны свободные рабочие расстояния объективов микроскопов и для чего необходимо их знать?

Каким винтом микроскопа следует производить наводку на рез­кость?

Как следует производить наводку" микроскопа на резкость, чтобы избежать повреждения объектива и препарата?

Как выявить наличие загрязнения в окуляре?

Как правильно приготовить бактериологическую петлю?

Как следует держать пробирку, петлю и пробку при взятии ма­териала для приготовления препарата?

Как предохранить культуру микроорганизма от загрязнения из воздуха?

Как производится негативная окраска препарата по Бурри?

Как выглядят бактерии в препарате, приготовленном по Бурри?

Как должно быть установлено освещение при микроскопии неокра­шенных препаратов ("раздавленная капля")?

Как устроен люминесцентный микроскоп?

Каким светом наиболее целесообразно вызывать люминесценцию препарата и почему?

Каково назначение желтого окулярного светофильтра в люминесцентном микроскопе?

Что такое флуорохромирование, какие флуорохромы чаще приме­няются?

В чем заключается принцип иммунофлуоресцентного метода иссле­дования?

Поиск по сайту: