Методические указания. К I мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е.соli1ас— добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг

§ I. а). Опыт трансдукции.

К I мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е.соli1ас^— добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас, в концентрации 10⁶-10⁷. Смесь инкубируют при 37⁰ в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без шага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е.coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-,str^s, (str^s- чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^-с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину).

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1.0 г; стрептомицина - 200 ед/мл; NH₄Cl- 1,0 г; NaС1- 0,5 г;Na₂HРO₄ - 6,0 г; КH₂PO₄- 3,0 г;Mg₂SO₄-0,2 г; дистиллированной воды - 170 л. Для тех же целей может быть испо­льзована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавля­ется 20,0 г. агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты. Культуры донор-ного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиен­та добавляют I мл 3- часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину. Чашки с посевом зарисовать.

Поиск по сайту: