 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Методические указания. § I. Определение LD50 по методу Рида и Менча
§ I. Определение LD50 по методу Рида и Менча. LD50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
Для определения LD50, например, для исследуемого вируса, готовят 10-кратные разведения вируссодержащего материала от 10-1 до 10-8, так как летальность животных прямо пропорциональна логарифму разведения.
После приготовления соответствующих разведений вируссодержащий материал вводят животным, например, белым мышам. Число животных может быть большим, но обычно каждым разведением заражают 4-6 мышей.
Срок наблюдения за животными после их заражения должен быть равен сумме двух средних инкубационных периодов. Учитывается гибель животных, наступающая в сроки, которые соответствуют инкубационному периоду.
Например, при заражении животных различными разведениями вируссодержащего материала получены следующие результаты (табл.1).
Статистическая обработка по методу Рида и Менча результатов заражения животных производится с использованием кумулятивных, т.е. суммарных данных опыта (табл.2).
Для определения LD 50 учитываются дозы, расположенные ближе всего к той, которая дает 50 % летальности. Ближайшая доза, дающая более 50% летальности, является высшей критической дозой (в нашем примере ей соответствует разведение вируса 10-4). Ближайшая доза, которая дает летальность менее 50 %, является низшей критической дозой (в нашем примере ей соответствует разведение 10-5).
Отношение разницы между летальностью, обусловленной высшей критической дозой и 50, к разнице между летальностями, обусловленными высшей и низшей критическими дозами, называется коэффициентом пропорциональности.
Определение LD50 для исследуемого вируса
(объяснение в тексте)
Таблица 1
| Разведения вируса | ||||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | |
| Число погибших животных |
Таблица 2
| Разведения вируса | Абсолютные данные | Кумулятивные данные | % летальности | ||
| Выжившие животные | Погибшие животные | Выжившие животные | Погибшие животные | ||
| 10-1 | |||||
| 10-2 | |||||
| 10-3 | |||||
| 10-4 | |||||
| 10-5 | |||||
| 10-6 | |||||
| 10-7 | |||||
| 10-8 |
Примечание: Если животное погибает раньше инкубационного периода, их исключают из опыта. Если последнее разведение вируса вызывает еще гибель животных, то его следует еще развести, так чтобы получить разведение, которое не вызывает гибель животных.
Рассчитываем коэффициент пропорциональности для нашего примера.
Коэффициент пропорциональности = 
LD50 соответствует сумме логарифма высшей критической дозы и коэффициенту пропорциональности. Для нашего примера LD50 =10-4,5
§ 2. Макро- и микроскопическое изучение культуры, выросшей из крови и органов белой мыши, вскрытой на предыдущем занятии. Обратить внимание на внешний вид и консистенцию выросшей культуры. Приготовить препарат-мазок и окрасить его по способу Ионэ для обнаружения капсулы. Зарисовать препарат.
§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
а)каждый студент получает одну пробирку с соответствующей культурой бактерий и проверяет её чистоту макро- и микроскопически; препарат-мазок окрасить; по Граму;
б)приготовить взвесь бактерий в физиологическом растворе, стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл физиологического раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть бактерий со среды;
в)с помощью стерильной пипетки перенести взвесь бактерий в стерильную пробирку и прогреть ее для умерщвления бактерий на водяной бане при температуре 70° в течение 30 минут для вибриона и 60 минут для кишечной палочки;
г)установить концентрацию бактерий во взвеси с помощью оптических стандартов, после чего приготовить необходимое разведение антигена.
§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
а)демонстрация различных способов иммунизации животных: подкожный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения антигенов;
б)демонстрация различных способов получения крови от иммунизированных животных: взятие крови из вен у кролика и у лошадей, взятие крови из сердца у кролика и морской свинки.
§ 5. Реакция агглютинации:
а)ориентировочная реакция на стекле. На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;
б)реакция агглютинации в пробирке. В опыт берут две пробирки, специально используемые для реакции агглютинации. В одну из них добавляют 0,5 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:25 (опыт), а в другую - 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл соответствующего антигена, содержащего в I мл I млрд микробных тел. После перемешивания пробирки помещают в термостат на 2 часа при температуре 370, после чего учитывают результат. В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность. При более длительном хранении пробирок (24 часа) в контрольной пробирке также может образоваться осадок, однако при встряхивании пробирок он разрушается и жидкость становится равномерно мутной.
Рис.1 Вибрион. Окраска по Грамму
Рис.2 Реакция агглютинации на стекле (1-опыт; 2-контроль).
Рис.3 Реакция агглютинации в пробирках (1-опыт; 2-контроль).
Контрольные вопросы
Как определяется LD50 по методу Рида и Менча?
Дайте определение понятиям "антиген" и "антитело".
Каковы основные свойства антигена?
Какие виды микробных антигенов Вы знаете?
Что такое анатоксин?
С какой целью применяются микробные антигены?
Что такое диагностикум?
Что такое вакцины?
Как готовится корпускулярный антиген?
Как определяется концентрация бактериальных тел во взвеси?
Что такое оптический стандарт?
Какие методы введения антигенов в организм животного Вы знаете?
Как получают иммунные диагностические сыворотки?
Какими свойствами обладают иммунные сыворотки?
Что такое агглютиноген и агглютинин?
Какие компоненты участвуют в реакции агглютинации?
Как ставится ориентировочная реакция агглютинации на стекле?
Для чего нужен контроль при постановке реакции агглютинации?
Каково практическое применение реакции агглютинации?
Поиск по сайту: