Методические указания. А. Микроскопические методы исследования

А. Микроскопические методы исследования

§ I. Устройство электронного микроскопа.

Возможности световых микроскопов ограничены волновой природой света. При оптимальных условиях световые микроскопы позволяют наблюдать, вследствие явления дифракции, объекты размером не менее 1/2 - 1/3 длины световой волны (около 0,2μ).

Наибольшими возможностями в смысле разрешающей способности обладают электронные микроскопы, в которых пучок света заменен пучком электронов, длина волны которых составляет 0,04-0,05А.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового микроскопа, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света заменен источником электронов, стеклянные линзы - линзами электромагнитными, В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, электропитания,

Электронно-оптическая система снабжена двумя конденсорными, объективной, промежуточной и проекционной линзами, обеспечивающими увеличение электронного микроскопа от 300 до 200000 крат. Промежу­точная и проекционная линзы обеспечивают плавное изменение увеличения при постоянном поле изображения.

фотографирование изображений при всех видах исследований производится на фотопластинки.

В комплект электропитания электронного микроскопа входят: шкаф питающего устройства, выпрямитель высоковольтный, пульт управления, щит распределительный, трансформатор высокочастотный, стабилизатор феррорезонансный, соединительные кабели. Устройство обеспечивает электрическое питание всех узлов электронного микроскопа от сети трехфазного переменного тока с напряжением 220 или 380В, частотой 50 гц.

Вакуумная система электронного микроскопа позволяет получать и поддерживать в процессе работы рабочий вакуум 2·10^-4 мм рт.ст. в колонне микроскопа, производить шлюзование камеры объекта и фотокамеры. Герметичность вакуумной системы и колонны микроскопа в местах их соединения обеспечивается применением резиновых уплотнителей. Вакуумная система состоит из следующих основных узлов: стояка, ва­куумного реле, высоковакуумного клапана, клапана распределитель­ного, комбинированной ловушки, камеры вакуумной, обходного клапана,

Рис.1 Оптическая схема электронного микроскопа. 1.Катод. 2.Первый конденсор. 3.Второй конденсор. 4. Столик объекта. 5. Объект. 6.Объективная линза. 7. Промежуточная линза. 8. Проекционная линза. 9.Люминесцирующий экран. 10. Фотокамера

ловушки предварительного разрежения, диффузионного насоса, вспомо­гательного диффузионного насоса, баллона предварительного разрежения, механического насоса.

Источником пуска электронов является электронная пушка, сос­тоящая из V -образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900° в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его различной толщины и плотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличенное изображение объекта. После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения диффракции с участков исследуемых образцов. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объектов, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с веществом люминофора Флуоресцирующего экрана на нем возникает видимое изображение объекта. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.

а) Приготовление пленок-подложек и их монтаж на предметные сетки

Электронномикроскопическому изучению могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточ­ные структуры, выделенные при разрушении клеток различными способами.

Для того, чтобы исследовать различные объекты в световом микроскопе, их помещают на предметное стекло. При электронномикроскопических исследованиях роль предметного стекла (оно не может быть использовано, так как непроницаемо для электронов) выполняют очень тонкие, прозрачные пленки-подложки, которые крепятся на опорные сетки.

Обычно для исследований применяют сетки, приготовленные из платины или чистой меди и имеющие до 100 ячеек на I мм². Они могут быть плетеными или изготавливаются специальным фотохимическим способом. Выпускаются как в готовом виде с внешним диаметром 2 или 3 мм. так и в виде полотна, из которого вырубаются специальны­ми пробойниками.

Толщина пленок-подложек должна быть не более 200А, так как более толстые пленки увеличивают угловое рассеивание электронов, отчего контрастность изображения и разрешение структур объектов значительно уменьшаются. Чаще всего для электронномикроскопи-ческих исследований биологических объектов применяют коллодиевые, формваровые и угольные пленки-подложки.

Благодаря своему заряду электроны слабо проникают через плотные среды. Поэтому объект для исследования должен быть макси­мально проницаемым для электронов. По этим же соображениям подложка должна быть электрононейтральной, чтобы не задерживать электронов, и бесструктурной, чтобы не затемнять структуру объекта. Кроме того, подложки должны быть прочными, чтобы выдерживать высокую температуру. Для получения, пленок-подложек из нитроцеллюлозы пользуются 1,5-2%-ными растворами коллодия в амилацетате (чистый коллодий получают путем выпаривания аптечного эфирного раствора коллодия).
Каплю раствора коллодия наносят на поверхность дистиллированной воды, налитую в чашку диаметром около 20 см. Капля быстро растекается по поверхности воды, и после испарения амилацетата образуется тонкая пленка.

Пленки из формвара (поливинилформальдегида) несколько прочнее, чем из коллодия, но получать их сложнее, так как растворители формвара - диоксан, дихлорэтан - не растекаются по поверхности воды, как амилацетат. Для получения формваровых пленок чистое, хорошо отшлифованное стекло опускают в раствор 0,1-0,2%-ного формвара в диоксане или дихлорэтане, затем вынимают и подсушивают 5-10 минут на воздухе. На стекле образуется тонкая пленка, которую об­резают по краям стекла, стекло опускают под углом 450 в чашку с водой, пленку осторожно снимают на поверхность воды.

В последнее время все чаще применяют углеродные пленки (они химически инертны, хорошо переносят электронную бомбардировку, термостойки), которые получают путем испарения углерода в вакуумной установке. В установку помещают чистое шлифованное стекло и при контакте двух графитовых стержней, на которые подается электрический ток, на стекло распыляют углерод. Затем тонкую пленку, полученную на поверхности стекла, снимают на поверхность воды, как и в случае снятия формваровой пленки.

После того как на поверхности воды образуется тонкая пленка, полученная одним из вышеописанных способов, на пленку аккуратно пинцетом наносят опорные сетки выпуклой стороной вниз. После этого поверх сеток накладывают листок фильтровальной бумаги и снимают его вместе с пленкой о поверхности воды. Сетки оказываются заключенными между пленкой и фильтровальной бумагой. Бумагу подсушива­ют, и сетки вместе с подложкой снимают осторожно пинцетом для размещения на них объектов, подлежащих микроскопическому исследованию.

б) Методы негативного и позитивного контрастирования

При рассмотрении объекта в электронном микроскопе и выявлении тонких деталей его строения важны два основных фактора: разрешающая способность микроскопа и контрастность объекта. Ряд биологиче­ских структур рассеивают электроны почти так же, как и пленка-под­ложка, в результате чего контрастность настолько мала, что даже при достаточной разрешающей способности микроскопа изображение объекта не будет различимо. Для увеличения контрастности применя­ют ряд методов.

Негативное контрастирование. В основе этого метода лежит принцип разности контрастов. При этом исследуемый объект смешивают с раствором соли тяжелого металла и наносят на сетку. Контрастирующее вещество окружает объект более низкой плотности, в результате чего малоконтрастный объект становится отчетливо различим на окружающем его темном фоне. В этом случае получают негативный эффект. Для негативного контрастирования применяют 2%-ный раствор уранилацетата или 2%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты.

Позитивное контрастирование. Известно, что соли тяжелых металлов могут специфически реагировать с различными биологическими веществами, тем самым они могут повы­шать контрастность соответствующих структур. Например, осмий хорошо реагирует с липоидными веществами, уранилацетат - с нуклеиновы­ми кислотами, соли свинца с белковыми компонентами клеток и тка­ней. Увеличение контрастности структур, возникающее после взаимодействия их с солями тяжелых металлов, обеспечивает позитивное контрастирование объекта, так как в результате "окраски" структуры становятся менее проницаемыми для электронов и выглядят темны­ми на светлом фоне препарата.

в) Метод оттенения

Для увеличения контрастности исследуемых объектов применяют также метод оттенения. При изготовлении образцов по этому методу исследуемый объект помещают в вакуумную напылительную установку и на него под определенными углами производят испарение металла (платины, палладия, золота, хрома, углерода) или их сплавов.

В тех местах, где объект будет экранировать пучок частиц, возникают тени. Рассеивание и поглощение электронов для различных участков объекта оказывается различным, в результате чего контрастность изображения возрастает. Этот метод позволяет не только увеличить контрастность, но и установить в ряде случаев размеры исследуемых объектов по длине тени и углу отклонения с использова­нием специальных формул.

§3. Методы получения ультратонких срезов

а) Способы фиксации и заливки биологических объектов

Основная цель фиксации - сохранить объект в таком состоянии, которое правильно бы отражало прижизненное состояние объекта. "В настоящее время в практике электронной микроскопии применяют хи­мические способы фиксации. По способу действия на живые структуры все химические фиксаторы разделяют на две группы:

1) фиксаторы, осаждающие (коагулирующие) белки - спирты, уксусная и пикриновая кислоты, соли тяжелых металлов, которые в основном применяют в световой микроскопии;

2) фиксаторы, стабилизирующие липиды - четырехокись осмия, формалин, перманганат калия.

Для фиксации клеток из культур микроорганизмом, выращенных на плотных и жидких средах, применяют 1%-ный раствор KMnO4 при­готовленный на ацетат-вероналовом буфере. При фиксации бактериаль­ных клеток по Ритер-Келленбергер применяют стандартный раствор: 1% OsO₄ в ацетат-вероналовом буфере (рН=6,0), в котором фиксатором является осмий.

После фиксации производят обезвоживание. В качестве обезвожи­вающих веществ используют этиловый спирт, метиловый спирт и ацетон, которые берут в возрастающих концентрациях (30°, 50°, 70⁰, 96°, 100⁰).

После обезвоживания объекты заключают в пластмассы или дру­гие среды. Так как оптимальная толщина срезов должна быть не более 250-800 А, то необходимо, чтобы заливочный материал обладал определенной твердостью и другими свойствами. Для этих целей исполь­зуют пластические массы - метакрилаты, эпоксидные смолы.

В практике электронной микроскопии чаще используют метакрилаты: бутилметакрилат и метилметакрилат. Бутилметакрилат полимеризуется в сравнительно мягкие блоки, поэтому к нему прибавляют 10-20% метилметакрилата. В качестве катализатора применяют 1-2%-ную перекись бензоила. Заливочную смесь (рабочую) заливают в желатиновые капсулы, где происходит полимеризация ее при 600 в тече­ние 48 часов.

б) Приготовление стеклянных ножей

Одним из самых важных этапов при получении ультра тонких срезов является процесс приготовления стеклянного ножа. Стеклянные ножи готовят из полос специального (зеркального) стекла, толщина которого должна быть 5 мм. Из такой полосы приготавливают квадраты размером 3x3 см, для чего стеклорезом вначале делают нарезки и по нарезу обламывают клетки-квадраты. Затем приготовленный квадрат надрезают по диагонали и разламывают.

Насечки стеклорезом производят таким образом, чтобы они не доходили до края стекла на 2-3 мм. После разламывания квадрата по диагонали с помощью лупы просматривают получившиеся лезвия. Обычно нож получается несколько неровным и только небольшая его, часть имеет ровный участок, который и используется в качестве лезвия.

В настоящее время промышленностью выпускается специальный прибор - станок для изготовления стеклянных ножей (ССН-1), который значительно облегчил процесс изготовления ножей. После изготовления ножа на нем укрепляют ванночку из лейкопластыря, и нож с ванночкой устанавливают в микротом.

Демонстрация приготовления стеклянных ножей с помощью прибора ССН-1.

в) Ознакомление с устройством ультрамикротома и получением ультратонких срезов

Незначительная проникающая способность электронов даже при больших ускоряющих -напряжениях требует изготовления сверхтонких срезов. Ультратонкие срезы получают на специальных приборах, называемых ультрамикротомами. В современных микротомах применяется тепловая подача металлического стержня, а через него и блока (объекта) по отношению к ножу. Для подготовки препарата к резанию необходимо, чтобы полушаровидныи конец цилиндрического блока был заточен в виде пирамидки, содержащей объект. Все операции по заточке блока производят под бинокулярной лупой МБС-1 или МБС-2. После подготовки блока к резке, его устанавливают в микротом таким образом, что после включения последнего блок начинает двигаться по отношению к неподвижно закрепленному ножу. Получающиеся при микротомии ультратонкие срезы остаются в ванночке ножа, которая предварительно заполняется дис­тиллированной водой. Срезы свободно плавают на поверхности жидкос­ти. Когда срезов накапливается достаточное количество, их собирают на сетке (прикосновением к поверхности жидкости).

§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.

§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. в методи­ческих указаниях к 4 практическому занятию.

Рис.2 Схема приготовления стеклянных ножей а)насечки для получения квадратов; б)насечка по диагонали; в)готовый нож.

Рис.3 Схема работы ультрамикротома 1.Объект 2.Блок 3.Нож 4.Ультратонкие срезы 5.Ванночка ножа, наполненная дистиллированной водой, на поверхности которой собираются ультратонкие срезы. 6. Лезвие ножа.

Поиск по сайту: